布鲁氏菌的比较基因组学及对巨噬细胞的毒性研究

发布时间：2018-04-26 12:20

  本文选题：布鲁氏菌 + 基因芯片　； 参考：《南京农业大学》2010年博士论文

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是一种全球性分布的危害严重的人兽共患传染病,严重影响我国畜牧业的发展。布鲁氏菌是布病的病原体,能感染包括人在内的多种宿主动物,动物布病主要表现为雌性动物流产、繁殖生育力下降；在雄性动物中,导致睾丸炎和附睾炎,常常发展为不育症；人布病主要表现为波浪热,严重者失去劳动力,而且在治疗上缺乏特异有效的治疗,给人类健康和畜牧业的发展造成了严重影响。依据对宿主偏好性的不同,布鲁氏菌分为6个经典种。根据培养和生物学特性的不同,6个经典种又分为19个亚型。布鲁氏菌的基因组研究已取得了很大进展,目前已有10株全序,囊括了主要的布鲁氏菌种,为布鲁氏菌的相关研究奠定了基础。不同的布鲁氏菌种具有不同的宿主感染范围,其中4个种能够感染人(B.melitensis, B. abortus, B. suis和B. canis)。不同种型的布鲁氏菌具有不同宿主范围和毒力特征,是由布鲁氏菌基因水平的差异引起。布鲁氏菌的光滑型菌株与粗糙型菌株对人和动物的致病力不同,光滑型菌株毒力强,而粗糙型菌株的毒力弱。布鲁氏菌是胞内寄生菌,在胞内的生存能力是其毒力的关键环节。光滑型菌株在巨噬细胞内具有很强的生存能力,一方面,布鲁氏菌能够在巨噬细胞内生存,另一方面,布鲁氏菌能抑制巨噬细胞的凋亡和死亡。粗糙型菌株在巨噬细胞内生存能力弱,并对巨噬细胞具有毒性。研究发现,粗糙型菌株的这种细胞毒性是由Ⅳ型分泌系统介导的。 为进一步认识布鲁氏菌种内分化和基因组的多态性,本研究利用全基因组芯片的比较基因组杂交,从基因获得与缺失的角度,分析不同种型布鲁氏菌基因水平的差异,探讨布鲁氏菌基因组的进化；利用MLVA技术,比较分析这些菌株的遗传多态性。通过比较标准毒株与疫苗株基因组成的差异,探讨疫苗株毒力减弱的可能机制,为了解减毒活疫苗的致弱机理和免疫保护机理提供依据。为进一步探讨光滑型菌株与粗糙型菌株的毒力差异的分子机制,以及Ⅳ型分泌系统在布鲁氏菌引起的细胞毒性中的作用,本研究中,我们从virB的过表达或缺失来认识这种细胞毒性是不是由布鲁氏菌粗糙型所特有,并探讨virB的过表达或缺失是否会影响光滑型布鲁氏菌在体外刺激条件下的生存能力。针对以上研究目的,本研究从以下六个方面进行研究：试验1布鲁氏菌全基因组DNA芯片的研制及比较基因组分析方法的建立 从基因库中下载B. melitensis 16M和B.abortus 9-941(?)勺基因组序列,提取各编码基因的序列,以16M的基因序列为主,加上941特异的基因序列,合计3218条基因,针对这些基因设计并合成引物。经过条件优化和重新设计合成引物等方法,利用大规模的PCR扩增,成功扩增了3212条基因。PCR产物纯化后点制醛基修饰的玻片,每个基因2个点,加上阳性和阴性对照,芯片上合计6912个探针。芯片上囊括了布鲁氏菌的3212条基因和阳性对照点。采用Cy3/Cy5双色荧光杂交技术,分别以16M和941作为参照和待测样本,并进行荧光双色杂交分析,成功建立了布鲁氏菌的比较基因组杂交分析方法。为我们后续进行比较基因组学分析以及基因表达谱的研究等奠定了基础。 试验2布鲁氏菌标准株的比较基因组杂交分析 利用建立的比较基因组杂交分析方法,对布鲁氏菌的19株不同亚型的标准菌株进行了比较基因组杂交分析。芯片结果显示,布鲁氏菌各个种之间的基因组构成上相似性非常高,与之前科学家发现的结果一致。根据芯片结果,在19株标准菌株中还成功鉴定了25个差异区域,这些差异区域至少包括2个连续的ORFs,即DFR01-DFR25。分析并讨论了这些差异区域在19株标准菌株中的分布情况。同时还发现一些菌株中出现基因的多拷贝情况,这些构成了布鲁氏菌不同种型以及亚型在基因组构成上的差异,深入研究布鲁氏菌种内遗传差异以及种内微进化。此外还分析了对人和动物致病的布鲁氏菌菌和非致病布鲁氏菌之间的基因差异,探讨了这些基因在不同菌株中的分布情况,推测了其可能在致病性上的作用。试验3布鲁氏菌疫苗株的比较基因组杂交分析 通过布鲁氏菌全基因组DNA芯片对4株减毒疫苗株(104M,M5,S19,S2)进行比较基因组杂交,发现疫苗菌株中的大片段基因缺失,同时也发现一些基因以多拷贝形式存在。研究了不同布鲁氏菌减毒活疫苗株之间以及与其亲本株之间基因组成上的差异,进而较深入地认识了布鲁氏菌减毒活疫苗株基因构成上的差异、免疫原性和保护力的遗传基础。利用布鲁氏菌全基因组DNA芯片进行比较基因组杂交,可以高通量检测分析布鲁氏菌减毒活疫苗的毒力基因和抗原蛋白基因,从而可以对任何一株活疫苗株进行预评价。 试验4差异基因功能分析以及基于差异基因的聚类分析 差异基因的获得或缺失反应了布鲁氏菌在自然界适应性进化的遗传基础。我们通过对19标准菌株和4减毒活疫苗株的芯片杂交,获得了25个差异片段在23株菌株中的分布情况,这些差异片段在不同菌株的Ⅰ和Ⅱ号染色体上的分布不均一,在Ⅰ号染色体共发现了12个DFRs,而在Ⅱ号染色体上发现了13个DFRs。从功能学角度分析了每个种型中缺失基因的功能,深入分析了由于缺失基因而导致每个型在生物特性、宿主专一性以及致病性上的一些差异。同时通过芯片中发现的25个缺失区段对布鲁氏菌进行了聚类分析,结果表明这25个DFRs聚类的结果与传统分型结果基本一致,为我们采用这25个DFRs对中国国内不同地域和不同时间分离的布鲁氏菌株进行系统发育图分析,了解我国布鲁氏菌菌种的演化和疫源地的拓展等奠定了基础,将有助于认识布鲁氏菌在中国的进化过程。 试验5基于15个MLVA位点对布鲁氏菌基因分型的初步研究 建立了15个MLVA位点的琼脂糖凝胶电泳及拷贝数计算的分析方法。应用15个位点分析了23株布鲁氏菌标准株、减毒活疫苗株和10株临床分离株的遗传多态性。结果表明这15个位点的能很好的区分不同种型以及亚型。其中8株临床分离株主要聚类在羊种2型,表明在松原市流行的菌株主要是羊种2型布鲁氏菌。其中有两株菌(S95和S178)聚类在疫苗株M5分支上,表明这两株菌和M5亲缘性更高。此外我们还对基于15个MLVA位点的聚类结果与前面基于25个DFRs聚类结果相比较,发现二者对布鲁氏菌的聚类结果基本一致,但也有一些小的差异,说明二者在分类上可以互为补充。试验6Ⅳ型分泌系统介导的光滑型布鲁氏菌对巨噬细胞的细胞毒性作用 利用质粒拯救的方法,克隆了编码T4SS的virB操纵子,并构建了其多拷贝质粒pBBR-VIR,转入野生株中得到过表达菌株(BM-VIR),比较分析了野生株、T4SS过表达株和突变株对巨噬细胞的细胞毒性和体外生存能力。结果显示,光滑性布鲁氏菌在高侵染比例下对巨噬细胞有细胞毒性,而且这种毒性依赖T4SS。缺失T4SS后,细胞毒性显著下降,而T4SS过表达时引起更强的细胞毒性。但T4SS过表达不影响布鲁氏菌在刺激条件下的生存能力,表明这种细胞毒性可能是由增加的效应子蛋白介导,而且是严格受T4SS所调控。进一步证实,光滑型菌株通过T4SS调控巨噬细胞的凋亡和死亡,是一个严谨调控的过程,而粗糙型菌株对巨噬细胞的毒性是由于T4SS的过度表达引起的。
[Abstract]:Brucism is a worldwide distribution of serious human and animal infectious diseases , which seriously affects the development of animal husbandry in China . The brucella is a pathogen of cloth disease , can infect a variety of host animals , including human , animal cloth disease mainly appears as female animal abortion , reproduction fertility decline ;
In male animals , leading to orchitis and epimitis , often develop into infertility ;
According to the differences of host preference , 6 classical species are divided into 6 classical species . According to the differences of culture and biological characteristics , 6 classical species are divided into 19 subtypes . According to the different culture and biological characteristics , 6 classical species are divided into 19 subtypes . Different host ranges and virulence features are different in different host ranges and virulence characteristics , which are caused by the difference of the gene level of brucella . The smooth type strains of brucella have different virulence to human and animal , but the virulence of the rough strains is weak . The smooth type strains have strong viability in macrophages . On the other hand , the bacteria can inhibit the apoptosis and death of macrophages .

In order to further understand the differentiation and genome polymorphism of brucella , this study used the comparative genomic hybridization of the whole genome chip to analyze the difference between the gene expression and the deletion of the gene from the gene and analyze the evolution of the genome of the brucella .
In order to further study the molecular mechanism of attenuated vaccine strain and the mechanism of immune protection , we study the molecular mechanism of attenuated vaccine and the mechanism of immune protection . In order to further study the molecular mechanism of virulence difference between smooth strain and rough strain , and to investigate whether the overexpression or absence of virB can affect the viability of smooth brucella in vitro stimulation .

The genomic sequence of B . melitensis 16M and B . abortus 9 - 941 ( ? ) was downloaded from the gene bank . The sequence of each coding gene was extracted . A total of 3212 genes were designed and synthesized .

Comparative genomic hybridization analysis of the standard strains of brucella test 2

A comparative genomic hybridization analysis of 19 strains of brucella was carried out using the established comparative genomic hybridization analysis method . The results showed that there were 25 difference regions among 19 standard strains , which included two consecutive ORFs , i.e . DFR01 - DFR25 .

Four attenuated vaccine strains ( 104M , M5 , S19 , S2 ) were subjected to genomic hybridization to find out the differences in gene composition between attenuated live vaccine strains and their parent strains .

Functional analysis of differential gene in experiment 4 and cluster analysis based on differential gene

Based on the analysis of 19 standard strains and 4 attenuated live vaccine strains , we obtained the distribution of 25 difference fragments in 23 strains . The results showed that there were 12 DFRs and 13 DFRs on chromosome 鈪，

本文编号：1806001