人源抗人干扰素hulFN-α1b基因工程抗体的筛选与研究

发布时间：2018-04-28 05:27

本文选题：噬菌体表面展示 + 干扰素α　；参考：《中国疾病预防控制中心》2009年博士论文

【摘要】：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种严重威胁人类健康的自身免疫疾病,研究表明人干扰素α (huIFN-α)与该疾病的发生有密切关系,这使其成为SLE临床治疗中重要的靶点分子,通过设计药物分子阻断IFN-α和受体结合,有望起到缓解和治疗SLE的目的。由于huIFN-α是一种自身免疫原,在健康人体内不能刺激人产生抗体,因此不能构建免疫抗体库来筛选基因工程抗体。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,从人源全合成抗体库中针对人干扰素α1b (huIFN-α1b)和α2b (huIFN-α2b)筛选抗人干扰素α的基因工程单链抗体,具体实验包括3个部分：一、抗人干扰素抗体的筛选、表达与鉴定针对高纯度的人干扰素huIFN-α1b蛋白分子,采用高通量的富集筛选策略,从2×109库容量的全合成人源抗体库中挑选了3000个克隆,其中20%针对IFNα1b呈阳性反应,有86株经phage ELISA验证对IFNα-1b, IFNα-2b,γ-干扰素,BSA抗原的反应,只对IFN α1b有特异性结合。通过对抗体的CDR3区的序列分析,根据抗体在CDR3的长度和序列上都不同,分别属于9个完全不同的单链抗体基因,其中有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。通过phage-ELISA对9株噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证,结果获得了5株稳定且特异针对huIFN-α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。将5株噬菌粒载体上的抗体基因克隆到scFv单链抗体原核表达载体pET22b,单链抗体蛋白通过pel序列引导,分泌到细菌的周质腔中,对周质腔中的scFv抗体蛋白采用金属螯合层析技术进行分离、纯化,从600ml培养基中得到了4mg以上的scFv单链抗体。通过ELISA和Western blot对5株单链抗体的结合特异性进行鉴定,得到3株与huIFN-α1b结合而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。将抗体的轻链和重链基因克隆到pAc-K-CH3载体系统,在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达全抗体蛋白,最终通过免疫荧光和SDS-PAGE分析,证明在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中,全抗体基因在昆虫细胞中高效分泌表达。表达的IgG全抗体蛋白采用proteinA亲和层析进行纯化,从1L培养基中得到20mg纯度在90%以上的纯化的全抗体蛋白。进一步通过ELISA和Western blot对全抗体的结合特异性进行鉴定,得到3株与huIFN-α1b结合而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源全抗体蛋白。二.抗体的表位、亲和力和功能活性鉴定采用竞争ELISA对3株抗体与抗原结合表位的相互关系进行鉴定,结果表明,全抗体AIFNal IgG1能够与3株单链抗体AIFNalscFv1、AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3竞争huIFN-α1b的表位,表明3株抗体与抗原huIFN-α1b的结合表位存在相互重叠的关系。采用竞争ELISA对3株全抗体与一株具有广泛结合人工型干扰素的鼠源单抗4G10与抗原抗原huIFN-α1b结合表位的相互关系进行鉴定,结果表明,3株全抗体与鼠源单抗4G1d在抗原huIFN-α1b的结合位置上存在重叠的区域,间接提示3株抗体也具有中和干扰素生物学功能的活性。采用BIAcore对抗体与抗原的结合活性的测定表明,这几株抗体(AIFNal IgG1、 AIFNal IgG2和AIFNal IgG3)与huIFN-α1b的亲和力KD分别为74.7×10-9、5.44×10-9、11.4×10-9,与干扰素的亲和力可以达到干扰素与受体的亲和力水平,为几株高亲和力的抗体。候选了受huIFN-α调控的基因ISG15和IFIT-1,采用Real-time PCR(实时定量PCR)验证干扰素.alb与其抗体在下游信号通路上的作用,结果表明在4小时时就能检测到抗体对ISG15和IFIT-1的表达有下调作用,且这种下调作用有剂量依赖效应,证明了抗体AIFNal IgG1能够阻断huIFN-α对下游基因ISG15和IFIT-1的诱导,间接说明了抗体是有功能活性的抗体。为了研究抗体所针对的抗原的功能表位,我们采用WISH-VSV系统,按微量细胞病毒抑制法进行了干扰素抗病毒活性中和实验,结果表明,3株抗体(AIFNal IgG1、AIFNal IgG2和AIFNal IgG3)在浓度达到200ug/ml时不能中和干扰素抗病毒活性,而对照鼠源单抗4G10在浓度达到100ug/ml时即能够中和干扰素抗病毒活性,这从抗体的生物学活性方面说明抗体所针对huIFN-α1b表位不是干扰素发挥抗病毒活性的表位。三.抗体-抗原相互作用的研究为了研究抗原-抗体的相互作用关系,我们将干扰素基因克隆pET30a,在大肠杆菌细胞中表达了人干扰素蛋白huIFN-α1b,表达的蛋白通过Western Blotting鉴定抗原表位。通过在干扰素基因上引入缺失突变,证明IFNalb的LoopAB区(29-35)在抗原-抗体相互作用中起有关键的作用,对该区域与相邻区域的氨基酸的定点突变和westernblot分析表明,IFN的27位的S,33位的D,34位的R,35的H,36位的D突变后,抗体与抗原的结合可减弱到不可检测的水平,为抗原-抗体相互作用的关键的氨基酸残基。以已有的干扰素a2b结晶的X-ray衍射3D结构模型为模板(huIFN-α1b和huIFN-α2b的序列相似性为83%),在Discovery Studio(DS)图像模拟系统中用protein moldeling程序构建了干扰素alb分子的模型。以抗体结构模型2A9M(2A9M和AIFNalscFvl的序列相似性为77%)为骨架,在Discovery Studio(DS)图像模拟系统中搭建完整抗体蛋白的结构模型,对得到的结构采用Chamm程序对力场进行优化,得到抗体能量最低的结构模型。在Discovery Studio(DS)图像模拟系统中,采用Z-dock程序,在高速的服务器上完成抗原-抗体结构的对接。分析对接的试验结果,参照RMSD、 E_Rdock等参数,得到了比较合理的对接试验结果,并且这一结果与表位研究的结果一致。综上所述,本研究运用噬菌体表面展示技术,在国际上首次从人源全合成抗体库中成功获得了3株特异性针对人干扰素alb的高亲和力人源基因工程单克隆抗体,其中有一株通过体外实验证明具有免疫调节的作用,并首次采用分子建模与表位图谱鉴定相结合的方法对干扰素α、干扰素a受体和干扰素抗体的结构关系进行了研究,对抗体的功能活性从结构学上进行了解析。本研究为缓解和治疗SLE带来了希望,对研究干扰素结构和功能的关系具有重要意义,为SLE分子机理的研究提供了基础。
[Abstract]:Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is a kind of autoimmune disease which threatens human health seriously . The study shows that human interferon 伪 ( huIFN - 伪 ) is closely related to the occurrence of the disease , which makes it an important target molecule in SLE clinical treatment .

Human interferon 伪1b ( huIFN - 伪1b ) and 伪2b ( huIFN - 伪2b ) were screened against human interferon 伪1b ( huIFN - 伪1b ) and 伪2b ( huIFN - 伪2b ) .

1 . Screening , expression and identification of anti - human interferon antibodies

A high - throughput screening strategy of human interferon huIFN - 伪1b was used to select 3000 clones from the total synthetic human antibody library of 2 脳 109 cubage .

The antibody gene of 5 strains of phage particles was cloned into the prokaryotic expression vector pET22b of scFv single - chain antibody . Single - chain antibody protein was secreted into the periplasm cavity of bacteria through pel sequence . The scFv antibody protein in periplasm was isolated and purified by metal chelate chromatography . The binding specificity of 5 single - chain antibody was identified by ELISA and Western blot .

The light and heavy chain genes of the antibody were cloned into pAc - K - CH3 vector system . The whole antibody protein was expressed in baculovirus / insect cell expression system .

II . Identification of epitopes , affinity and functional activity of antibodies

In order to study the binding activity of monoclonal antibodies against human interferon - 伪1b , the results showed that the binding sites of the three antibodies ( AIFNal IgG1 , AIFN伪 , IgG3 ) and huIFN - 伪1b could not neutralize the antiviral activity of IFN - 伪1b . The results showed that the antibodies ( AIFNal IgG1 , AIFNal , and AIFNal IgG3 ) could not neutralize the antiviral activity of IFN - 伪1b .

III . Studies on the Interaction of Antibody - antigen

In order to study the interaction between antigen and antibody , we cloned pET30a and expressed human interferon protein huIFN - 伪1b in E . coli cells .

In conclusion , we have successfully obtained three monoclonal antibodies specific to human interferon alb from human - source all - synthetic antibody library by using phage surface display technology . One of them has been proved to be immune - regulated by in vitro experiments , and the structural relationship between interferon - 伪 , interferon - a receptor and interferon antibody is studied by molecular modeling and epitope map identification for the first time . The study provides a basis for studying the relationship between interferon - 伪 , interferon - a receptor and interferon antibody , which is of great significance to study the relationship between interferon structure and function .

【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】