人骨髓间充质干细胞软骨分化相关性microRNA的筛选

发布时间：2018-04-28 09:13

  本文选题：骨髓间充质干细胞 + miRNA　； 参考：《第四军医大学》2009年硕士论文

【摘要】： 目的通过检测人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其诱导分化的软骨细胞中miRNA基因的表达谱,筛选出诱导分化前后差异表达的miRNAs,寻找可能的人BMSCs向软骨分化过程中具有调控作用的miRNAs,为进一步阐明miRNA在BMSCs软骨分化过程中的作用和意义提供实验基础。 方法(1)利用密度梯度离心法自人骨髓中分离BMSCs,在体外扩增传代培养,通过对其形态特点的观察及细胞表面标志物检测,对培养的人BMSCs进行鉴定。(2)采用体外细胞团三维培养方法,用含有TGF-β1、地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白和维生素C的培养液诱导人BMSCs向软骨细胞方向分化,通过甲苯胺蓝、s-100蛋白免疫组织化学染色对诱导分化的软骨细胞进行鉴定。(3)利用miRNA基因芯片技术,检测人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞miRNAs的表达谱,通过SAM软件分析筛选出人BMSCs和其分化的软骨细胞之间表达差异性的miRNAs。(4)采用实时定量PCR方法对筛选出的差异表达的miRNA基因进行验证并预测其潜在的靶基因。 结果(1)经骨髓分离培养所得到的细胞,通过流式细胞仪检测的结果为:细胞表面标志物CD29、CD44为阳性,CD34、CD45为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征。(2)人BMSCs经TGF-β1、地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白和维生素C诱导21天后,甲苯胺蓝、s-100蛋白免疫组织化学染色均阳性,符合软骨细胞的特征。(3)用miRNA基因芯片检测了两组样品中人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞miRNAs的表达谱,并筛选出了在该两种细胞中表达的差异性的miRNAs。在两组样品中,软骨细胞较BMSCs高表达的miRNAs分别为:26个、7个(两组共同存在的为5个);软骨细胞较BMSCs低表达的miRNAs在两组样品中分别为:1个、2个(两组共同存在的为0个)。(4)针对筛选出的4个在软骨中高表达的miRNAs利用实时定量PCR的方法在第3组样品中进行验证,结果均与芯片检测的结果一致。 结论(1)用密度梯度离心法可以从骨髓中分离得到人BMSCs,并可在体外培养将其诱导分化为软骨细胞。(2)来自不同个体的人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞之间miRNAs的表达存在很大差异性(3)在人BMSCs和其诱导分化的软骨细胞之间存在表达差异的miRNAs,这些差异性的miRNAs可能对人BMSCs的软骨诱导分化起着一定的调控作用。
[Abstract]:Objective to detect the expression profile of miRNA gene in human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and its differentiated chondrocytes. The differentially expressed miRNAss before and after differentiation were screened, and the possible miRNAss which could regulate the differentiation of human BMSCs into chondrocytes were found, which provided the experimental basis for further elucidating the role and significance of miRNA in the process of BMSCs cartilage differentiation. Methods BMSCs were isolated from human bone marrow by density gradient centrifugation and cultured in vitro. Human BMSCs was identified by means of morphological observation and cell surface marker detection. Human BMSCs was induced to differentiate into chondrocytes by medium containing TGF- 尾 1, dexamethasone, insulin, bovine serum albumin and vitamin C. The differentiation of chondrocytes was identified by immunohistochemical staining of toluidine blue-100 protein. The miRNAs expression profile of human BMSCs and its differentiated chondrocytes was detected by miRNA gene chip technique. The differential expression of human BMSCs and its differentiated chondrocytes was screened by SAM software. MiRNas. 4) the differentially expressed miRNA genes were verified by real-time quantitative PCR and their potential target genes were predicted. Results 1) the cells isolated from bone marrow were detected by flow cytometry. The results of flow cytometry showed that CD29 + CD44 was positive and CD34 + CD45 was negative, which was consistent with the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Human BMSCs was transfered by TGF- 尾 _ 1, dexamethasone, insulin, and the results were as follows: (1) TGF- 尾 _ 1, dexamethasone and insulin were detected by flow cytometry. After induction of bovine serum albumin (BSA) and vitamin C for 21 days, the immunohistochemical staining of toluidine blue-100 protein was positive. According to the characteristics of chondrocytes, the miRNAs expression profiles of human BMSCs and chondrocytes induced by chondrocytes in two groups were detected by miRNA gene chip, and the differentially expressed miRNAs were screened out in the two groups of chondrocytes. In two sets of samples, There were 26 chondrocytes with higher miRNAs expression than BMSCs, 7 chondrocytes (5 chondrocytes co-existed in chondrocytes), and 1 chondrocyte miRNAs with lower expression than BMSCs in two groups. Four highly expressed miRNAs in cartilage were verified by real-time quantitative PCR in group 3. The results are consistent with the results of chip detection. Conclusion: human BMSCs can be isolated from bone marrow by density gradient centrifugation and can be induced to differentiate into chondrocytes in vitro. There are significant differences in the expression of miRNAsbetween human BMSCs and chondrocytes induced by BMSCs, and these differential miRNAs may play a role in regulating the differentiation of human BMSCs.
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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