异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗的制备及抗小鼠肿瘤作用研究

发布时间：2018-05-02 02:18

  本文选题：肿瘤 + 表皮生长因子受体　； 参考：《复旦大学》2008年硕士论文

【摘要】： 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是原癌基因c-erbB基因编码的170kDa跨膜糖蛋白,具有胞内酪氨酸激酶活性。由于在多种上皮恶性肿瘤中,EGFR都发生一定程度的突变或异常高表达,且与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此,EGFR是一种肿瘤的标志性抗原,可将其作为肿瘤治疗的靶点之一。 本研究首次将鸡源EGFR(cEGFR)胞外Ⅱ-Ⅲ区作为抗原,免疫球蛋白IgG-Fc片段作为疫苗载体分子与cEGFR片段融合,构建了重组DNA疫苗和蛋白质疫苗,评价这两种疫苗在小鼠Lewis肺癌模型中的抗肿瘤主动免疫疗效,探讨其抗肿瘤作用机制。我们用重叠延伸PCR法扩增获得cEGFR-Fc融合基因,克隆至pVAX1质粒构建重组DNA疫苗pVAX1-cEGFR-Fc,同时,构建载有溶葡球菌酶信号肽序列的pET-28a(+)-S公用分泌型大肠杆菌表达载体,将cEGFR-Fc融合基因克隆至该载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达的融合蛋白cEGFR-Fc经Protein A亲和层析纯化后作为蛋白疫苗。48只C57BL/6J小鼠随机平分为4组:单用DNA疫苗组、单用蛋白质疫苗组、DNA疫苗和蛋白疫苗联合免疫组及生理盐水对照组,各组小鼠免疫4次后接种Lewis肺癌细胞,观测肿瘤生长情况及小鼠生存状态及毒副反应。19天后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤称重并计算抑瘤率。Western blot法检测小鼠血清中是否产生了抗EGFR抗体,ELISA法检测抗体滴度。分离免疫小鼠脾脏细胞,检测淋巴细胞对靶细胞A431的细胞毒性作用。 本研究成功构建了重组质粒pVAX1-cEGFR-Fc和pET28a(+)-S-cEGFR-Fc,其中,pET28a(+)-S-cEGFR-Fc转化大肠杆菌后,经诱导表达在发酵上清液中获得了30～35%分泌蛋白,经Protein A亲和层析纯化,得到纯度达85%以上的重组融合蛋白。动物实验结果表明,三疫苗组小鼠肿瘤明显小于生理盐水对照组(P＜0.01),联合免疫组小鼠肿瘤亦明显小于DNA疫苗组、蛋白疫苗组(P＜0.01)。DNA疫苗组、蛋白质疫苗组和联合免疫组抑瘤率分别为37%、49%和63%。三疫苗组小鼠血清中均有抗EGFR抗体产生,其中联合免疫组抗体滴度最高,蛋白质疫苗组次之,DNA疫苗组最低。免疫后的小鼠脾脏细胞对EGFR受体高表达的A431细胞具有杀伤作用,效靶比为10:1时具有最大杀伤率。 本研究证实,异种同源EGFR胞外Ⅱ-Ⅲ区重组DNA疫苗和蛋白质疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受,产生特异性免疫反应,对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用。两种疫苗的联合使用可进一步加强抑瘤作用。
[Abstract]:Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a transmembrane 170kDa glycoprotein encoded by proto-oncogene c-erbB gene and has intracellular tyrosine kinase activity. Because EGFR has a certain degree of mutation or abnormal overexpression in many kinds of epithelial malignant tumors, it is closely related to the poor prognosis of tumor patients. Therefore, EGFR is an iconic antigen of tumor, which can be used as a target of tumor therapy. In this study, the recombinant DNA vaccine and protein vaccine were constructed by fusion of the extracellular region 鈪，

本文编号：1831975