撤除生长因子对hUCMSCs增殖和细胞外基质表达的影响

发布时间：2018-05-04 18:02

  本文选题：脐带间充质干细胞 + 生长因子　； 参考：《山东大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的： 人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)具有多向分化潜能和自我更新能力,其诱导植入有望成为应用广泛的细胞治疗手段。为了快速获得足够数量的hUCMSCs,研究人员常在培养基中添加生长因子以促进细胞生长。但是当hUCMSCs输入人体后,没有添加的生长因子的继续作用,细胞的增殖、迁移及定植能力是否会受到影响呢?细胞外基质与细胞的增殖、迁移及定植能力密切相关,因此本实验研究了细胞外基质的表达情况。 本研究的目的是：1.研究完全撤除表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)对细胞增殖及细胞外基质表达的影响。2.保留半量的EGF、bFGF、VEGF是否可以维持细胞增殖及细胞外基质的表达。 方法： 1. hUCMSCs的分离培养及表型鉴定脐带在采集后6 h内用植块法分离培养,每3-4d换液1次,达到80%融合时以细胞密度5×104个/cm2传代培养,取第5代稳定生长的hUCMSCs用流式细胞仪进行表型鉴定。 2.实验分组取第5代hUCMSCs,细胞生长达70%融合时为细胞换液撤除因子,并将细胞分为三组：对照组,生长因子浓度同前；实验组1,将生长因子浓度突然减半；实验组2,所换培养基不添加任何生长因子,仅含正常浓度的血清。 3.瑞氏-姬姆萨法染色观察细胞形态：将第5代hUCMSCs接种至24孔板,细胞生长达70%融合时按分组为细胞换液,继续培养30小时后行瑞氏-姬姆萨法染色观察细胞形态。 4.MTT法细胞计数：按分组将第5代hUCMSCs种植于96孔板,每孔加入5×103个细胞(200μL),在37℃、5%C02条件下孵育30小时后进行MTT法计数。 5.实时定量PCR (real-time Q-PCR)检测细胞凋亡相关基因及胞外基质基因的表达。 5.1 Trizol法提取总RNA将细胞接种至6孔板,细胞生长达70%融合时为细胞换液,分上述3组,继续培养15小时后吸出培养液,每孔加入Trizol 1 ml,提取总RNA。 5.2紫外分光光度法测所提取总RNA浓度,按说明书进行反转录制备cDNA。 5.3实时定量PCR检测胶原蛋白-Ⅰ(Collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ),胶原蛋白-Ⅳ(Collagen-Ⅳ, Col-Ⅳ),纤连蛋白(Fibronectin, FN),层粘连蛋白(Laminin, LN),整合素(Integrin),粘胶蛋白(Tenascin-C),基质金属蛋白酶-2(MatrixMetalloprotease-2, MMP-2),基质金属蛋白酶-7(Matrix Metalloprotease-7,MMP-7),基质金属蛋白酶-9 (Matrix Metalloprotease-9, MMP-9), BCL-2,BAX基因的表达情况。 结果： 1.细胞表形检测结果 所获得的贴壁细胞CD34和CD45阴性表达,CD44、CD105、CD71、CD90阳性表达,符合间充质干细胞的特征。 2. hUCMSCs的形态学观察 2.1对照组：细胞扁平或长梭形,可见突起,胞核较大,扁卵圆形,染色质细小稀疏着色浅,核仁明显,胞质较丰富,呈弱嗜碱性,可见嗜碱性颗粒。 2.2实验组1：细胞扁平或长梭形,部分细胞较对照组变大、变圆,核质比减小。 2.3实验组2：多数细胞较对照组变大、变圆,核质比减小 3.MTT法细胞计数结果 与对照组相比,实验组2细胞数目减少,但不具显著差异(P=0.16)；实验组1细胞数目略有增加,亦不具显著差异(P=0.49)。 4.实时定量PCR结果 4.1凋亡相关基因BCL-2和BAX表达情况撤除生长因子后BCL-2表达上调,BAX表达下调,BCL-2/BAX比率增大,实验组1较实验组2 BCL-2表达上调、BAX表达下调幅度更大,BCL-2/BAX比率更高。 4.2胞外基质基因表达情况与对照组相比,半量撤除因子时,Col-Ⅰ、FN、LN、Integrin和Tenascin-C表达增高,完全撤除时Col-Ⅰ、FN表达增高,LN、Integrin和Tenascin-C表达下调。而Col-Ⅳ、MMP-2、MMP-7和MMP-9半量撤除和完全撤除时均减少,完全撤除时减少更多。 结论： 1.撤除EGF、VEGF、bFGF会降低hUCMSCs的增殖能力,保留半量生长因子可以维持hUCMSCs的增殖能力。 2.撤除因子可导致细胞体积变大,核质比减小。 3.撤除因子后,BCL-2/BAX比率增大,细胞的抗凋亡能力增强,半量撤除时细胞的抗凋亡能力较完全撤除时更强。 4.撤除生长因子会影响细胞外基质的表达,而保留半量生长因子可以改善这种情况。
[Abstract]:Objective:
Human umbilical cord mesenchymal stem cells (human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs) have multidirectional differentiation potential and self-renewal ability. Their induction implantation is expected to be a widely used cell therapy. In order to obtain a sufficient quantity of hUCMSCs, researchers often add growth factors to promote cell growth in the medium. But when hUCMSCs is inputted to the human body, does the proliferation, migration and colonization of cells affect the proliferation, migration and colonization of the cells without the addition of growth factors? The extracellular matrix is closely related to the proliferation, migration and colonization of cells. Therefore, the expression of extracellular matrix is studied in this experiment.
The purpose of this study is: 1. to study the total removal of epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, bFGF), and the effect of vascular endothelial growth factor (vascular endothelial cell) on cell proliferation and extracellular matrix expression A half dose of EGF, bFGF and VEGF can maintain cell proliferation and extracellular matrix expression.
Method锛，

本文编号：1844027