缺氧预处理对脐带间充质干细胞血管生长因子表达的影响

发布时间：2018-05-07 06:07

  本文选题：脐带 + 间充质干细胞　； 参考：《天津医科大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的探讨人脐带间充质干细胞分离、培养的方法,研究氯化钴(CoCl2)缺氧处理对脐带间充质干细胞生物学特性的影响,探讨CoCl2模拟缺氧预处理对脐带间充质干细胞中碱性成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达及蛋白分泌的影响。 方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,利用PBS冲洗脐动脉、静脉,将血液冲洗干净,将其剪碎至1mm3后,加入0.1%Ⅳ型胶原酶,置37℃恒温振荡仪振荡消化60min,加入0.25%胰酶,再次恒温振荡30min,PBS稀释后滤网过滤,收集细胞滤液,离心去除上清液,PBS洗涤2遍,DMEM/F12重悬细胞,调整细胞密度为5×106/ml,接种于75cm培养瓶,置37。C、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,48h后换液,去除悬浮细胞。以后每7d换液1次,细胞生长至80%～90%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1：3传代,应用倒置相差显微镜隔日观察细胞生长形态,取第3代的UC-MSCs流式细胞仪检测其表面标志(CD34、CD45、CD90、CD105、CD29及CD49)；MTT法检测不同浓度(0、50、100、150、200、250μmol/L) CoCl2对UC-MSCs活力及增殖的影响；运用含150μmol/L的CoCl2培养液培养细胞72 h,用流式细胞仪检测缺氧对UC-MSCs表面标志物(CD34、CD45、CD90、CD105、CD29及CD49)；依据CoCl2的浓度(0、50、100μmol/L及150μmol/L)将UC-MSCs分为4个组,即对照组、低、中、高CoCl2组,每个组处理24 h、48 h和72 h。用SYBRGREN荧光定量RT-PCR检测bFGF、VEGF mRNA的表达,用ELISA法检测bFGF和VEGF蛋白的表达。 结果利用胶原酶及胰酶两步消化法能充分消化脐带,易于获得间充质干细胞,倒置显微镜观察显示：培养24h后,可见散在的细胞贴壁,贴壁细胞呈长梭形或不规则形；培养4～5d后,贴壁细胞明显增多,胞体中央膨大,细胞呈长梭形或不规则形；培养8～9d后,细胞铺满培养瓶底面,呈漩涡状或辐射状生长,细胞传代后,观察细胞形态仍为长梭形,不规则形,呈漩涡样生长；经含150μmol/L CoCl2的培养液缺氧预处理,UC-MSCs仍高表达CD90、CD29、CD49及CD105,低表达CD34和CD45,倒置相差显微镜观察,细胞形态仍为长梭形或不规则形；未加CoCl2组(对照组)细胞生长曲线呈“S”形。经CoCl2处理后,各组细胞生长曲线呈不太明显的“S”形,对数生长期提前,缺氧的前1～3d细胞增殖速度加快,对数期比对照组缩短,第3天之后增殖速度减慢,提前达到饱和密度,进入平台期,第4-5天甚至呈逐渐降低趋势,使平台期不明显,CoCl2浓度较高(200、250μmol/L)时,细胞生长曲线趋于低平；bFGF、VEGF基因的表达具有时间和剂量依赖性。bFGF mRNA表达水平在各时点均明显高于对照组(0μmol/L组),差异有统计学意义(P0.05);50μmol/L CoCl2处理后,24、48、72h三个时点mRNA表达水平无显著差异；100μmol/L CoCl2处理后,随时间延长,mRNA表达水平逐渐增高(P0.05);150μmol/L CoCl2处理后,48h时点mRNA表达水平明显高于24h时点,但72h时点mRNA表达水平明显低于48h时点。bFGF的蛋白表达与基因表达一致,但50μmol/L CoCl2处理组在各时点没有显著差异；VEGF mRNA的表达各时点均明显高于对照组(0μmol/L组),差异有统计学意义(P0.05),50μmol/L CoCl2处理后,24、48、72h三个时点mRNA表达水平无显著差异(P0.05);100μmol/L及150μmol/L CoCl2处理后,随时间延长,mRNA表达水平逐渐增高(P0.05),均在48h达到高峰；在48h时点,150μmol/L组明显高于100μmol/L组,差异有统计学意义(P0.05),bFGF、VEGF的蛋白表达与基因表达一致。 结论适当浓度的CoCl2(150μmol/L)对UC-MSCs的生物学功能影响轻微。CoCl2可用于细胞的模拟缺氧,缺氧预处理对人UC-MSCs bFGF、VEGF的分泌具有促进作用,以含150μmol/L CoCl2的培养液培养48 h,为促进bFGF、VEGF基因和其蛋白表达的最适条件。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of CoCl2 on the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells , and to explore the effect of CoCl2 on the expression of basic fibroblast growth factor ( bFGF ) and vascular endothelial growth factor ( VEGF ) gene and protein secretion in umbilical cord mesenchymal stem cells .


Methods The umbilical cord of caesarean section was collected under aseptic conditions . The umbilical artery and vein were washed with PBS . After cutting to 1mm3 , 0.1 % type 鈪，

本文编号：1855705