人骨髓间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的影响及其机制的实验研究

发布时间：2018-05-15 18:24

本文选题：间充质干细胞 + 异体T淋巴细胞　；参考：《河北医科大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的:利用异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病己经越来越成为血液病的常规治疗手段,而异基因干细胞移植后GVHD是限制移植技术发展的最大障碍。如何防治GVHD已经成为这一领域研究的重点。研究显示,间充质干细胞可能有抑制GVHD作用。在BMT的同时植入包含供者骨髓间充质干细胞在内的骨髓作为造血微环境,发生GVHD的危险性显著降低。进一步研究提示体外培养扩增的人间充质干细胞也可以减轻GVHD反应,提高异基因干细胞移植的成功率。我们通过体外培养扩增HBM-MSCs,并与纯化后的异体外周血T细胞进行接触和非接触共培养,观察其对PHA刺激的T细胞增殖及调节T细胞亚群数量的影响,探讨MSCs抑制GVHD可能的作用机制,为MSCs在GVHD防治中应用提供理论依据。方法: 1 BMMSCs的培养、扩增及鉴定 1.1 BMMSCs的分离、培养及扩增:取肝素抗凝非恶性病患者骨髓液,Ficoll分离液分离单个核细胞,接种于25cm2一次性无菌塑料培养瓶中,37℃,5%CO2饱和湿度培养。72小时后首次全量换液,此后每3-4天换液一次。待贴壁细胞层融合达80-90%以上时,胰酶消化传代。 1.2生长曲线测定:分别取P1、P3、P5生长良好细胞接种于96孔板,MTT法检测细胞增殖活性,每代细胞连续观察8天。将每天的OD值取均值,做生长曲线分析。 1.3 BMMSCs鉴定 1.3.1倒置显微镜下直接活体观察。 1.3.2取P3细胞,做细胞爬片,瑞氏吉姆萨染色,显微镜下观察。 1.3.3收集P3、P5细胞,选取CD34-PE、CD45-PerCP、CD44-FITC单抗,流式细胞仪进行免疫表型测定。 2 T细胞分离纯化 2.1外周血单个核细胞(PBMNC)分离:取新鲜健康献血志愿者外周血过滤的白细胞,Ficoll分离液分离单个核细胞。 2.2 T淋巴细胞纯化:取处理后的尼龙毛柱,加入PBMNC悬液,37℃,5%CO2饱和湿度孵育1小时,纯化T淋巴细胞。 2.3 T细胞纯度检测:取尼龙毛柱纯化前和纯化后细胞,选取CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-PE单克隆抗体,流式细胞仪检测免疫表型。 3 MSCs与T淋巴细胞共培养 3.1实验分组A:BMMSCs空白对照组; B:BMMSCs+PHA对照组; C:BMMSCs+T细胞接触培养组; D:BMMSCs+T细胞接触培养PHA刺激组; E:BMMSCs+T细胞非接触培养组; F:BMMSCs+T细胞非接触培养PHA刺激组; G:T细胞空白对照组; H:T细胞PHA刺激对照组;每组实验重复3次。MSCs:T为1:20。PHA浓度50ug/ml。 3.2 MSCs制备:取P4代生长良好MSCs,按分组接种于6孔板,设3复孔,同时按相同条件和密度接种MSC于96孔板,设6复孔,待细胞完全贴壁后,以60Coγ5Gy照射去增殖处理。 3.3 MSCs接触培养对T细胞的影响观察:接种T细胞于已制备好MSCs的6孔板内,用于T细胞表型和PCR检测;同时按相同条件和密度接种于已制备好MSC的96孔板内,用于细胞增殖检测。加入PHA作为刺激原,同时分别设置无PHA刺激组作为对照。 3.4 MSCs非接触培养对T细胞的影响观察:在已制备好MSCs的6孔板内放置Transwell小室,接种T细胞于小室内,用于T细胞表型和PCR检测。加入PHA作为刺激原,同时设置无PHA刺激组作为对照。 3.5对照组:按相同条件和密度设置单独T细胞和单独MSCs培养组,加入PHA作为刺激原,同时分别设置无PHA刺激组作为对照。 4 T细胞增殖检测:MTT法检测T细胞增殖活性。 5 CD4、CD25检测:选取CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-PE单克隆抗体,流式细胞仪分析,检测不同培养条件下免疫表型变化。 6 Foxp3mRNA表达检测 6.1取共培养后细胞,提取总RNA。取提取物测OD260/OD280。RNA电泳检测RNA完整性。逆转录合成cDNA。 6.2 realtime PCR检测不同培养条件下Foxp3 mRNA表达变化。Foxp3引物:上游(5'→3') : GTCTGGGCTCATAGGCACATT ,下游(5'→3') :ATGGCGTTCTGTGGAAGGC,片段长度116bp。β-actin引物:上游(5'→3') :CTGGCACCACACCTTCTACAAT,下游(5'→3'):AATGTCACG CACGATTTCCCGC,片段长度382bp。PCR反应体系为25μl ,包括cDNA2μl,上下游引物各1μl,2.5×Real MasterMix 10μl,20×SBYR GREEN 1.25μl,DEPC水补足至25μl。反应条件:95℃,3min×1cycle预变性;94℃,25sec;54℃,30sec×35cycles扩增;95℃,15sec;60℃,1min;95℃,15sec;60℃,15sec×1cycle溶解曲线分析。所有检测实验均包含一个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。分析样本Ct值,以β-actin表达量作为内对照,结果采用2[Ct(β-actin)-Ct(Foxp3)]表示。 7统计学分析 SPSS 17.0软件分析,分组资料以均数±标准差表示,进行单因素方差分析,Dunnett’S T3法进行两两比较,以P0.05为差异有统计学意义。结果: 1骨髓间充质干细胞培养扩增及生物学特性原代细胞接种后4 h部分圆形细胞开始贴壁,24 h可见贴壁细胞伸展为呈纤维状,72小时后可见贴壁细胞呈克隆样生长, 8～10d后集落逐渐增多并融合成片,约两周左右细胞融合成单层,呈旋涡状或平行排列。传代细胞24h可完全贴壁、伸展,并保持原代细胞形态特征,均匀散在分布生长。P3以后细胞生长速度加快,P9以后细胞生长减慢。 P3细胞瑞-吉染色细胞呈纤维状生长,旋涡状排列,细胞形态均一,胞体细小,胞核致密,核仁可见。对1、3、5代细胞进行生长曲线测定显示,1-2d细胞增殖较慢,处于潜伏期;3-6d是细胞对数生长期,7d后细胞生长速度减慢进入平台期。本培养体系中细胞倍增时间约为40h。免疫荧光分析细胞高表达间质细胞表面标记CD44(P3、P5代平均阳性率分别为93.61%、96.03%),低表达造血干细胞标记CD34 (P3、P5代平均阳性率分别为1.56%、1.26%)和CD45(P3、P5代平均阳性率分别为5.16%、1.0%)。符合MSC的免疫学特征。 2 T细胞观察及表型检测 T细胞形态呈小圆形,流式细胞学检测结果显示尼龙毛纯化前CD3平均阳性率24.2%,纯化后CD3平均阳性率86.43%。 3 MSCs与T细胞共培养形态学观察光镜下观察A(MSC单独培养)、B(MSC+PHA培养)组无明显区别,提示PHA刺激对MSC无影响。PHA刺激后T细胞成团聚集生长,H(T+PHA培养)组细胞聚集生长最为显著,D(MSC+T+PHA接触培养)、F(MSC+T+PHA非接触培养)组可见细胞聚集生长,均不如H组明显,而F组较D组明显。无PHA刺激的C(MSC+T接触培养)、E(MSC+T非接触培养)、G(T细胞单独培养)组未见T细胞聚集生长,组间无明显区别。PHA刺激可引起T细胞增殖,但MSC存在的条件下,PHA刺激的T细胞增殖明显减低,而MSC接触培养的T细胞增殖减低较非接触培养明显。 4 MSC对T细胞增殖的影响无PHA刺激的C、E、G组OD值分别为0.033±0.013、0.052±0.04、0.081±0.024,而PHA刺激的D、F、H组OD值分别为0.14±0.023、0.234±0.027、0.948±0.076。C、E、G组T细胞增殖均低于D、F、H组(0.01P0.05)。提示PHA在各种情况下均可刺激T细胞增殖。无PHA刺激的C、E、G组中,C组T细胞增殖低于G组(0.01P0.05),而C组与E组、E组与G组间差异不明显(P0.05),以G组为对照,C、E组增殖抑制率分别为(55.05±5.55)%、(30.73±2.42)%。提示MSC与T细胞共培养不会刺激T细胞增殖,在无PHA刺激条件下MSC接触培养对T细胞的活性有一定抑制作用,可能与诱导了部分T细胞的凋亡有关,而非接触培养无明显抑制作用。 PHA刺激的D、F、H组间比较差异均具有显著性(P0.01),加MSC共培养的D、F组T细胞增殖明显低于无MSC的H组,而接触培养的D组增殖低于非接触培养的F组,以H组为对照,D、F组增殖抑制率分别为(85.20±2.24)%、(75.26±2.90)%。MSC接触培养和非接触培养均对PHA刺激的T细胞增殖有明显抑制作用,而接触培养抑制作用强于非接触培养,提示MSC可能通过细胞间接触和分泌可溶性因子(非接触作用)两种途径抑制T细胞增殖,其中细胞间接触途径可能作用更强。 5 MSC对T细胞CD25表达的影响 CD25是淋巴细胞表面表达相对较早的标记,可作为T细胞增殖活性检测的一个指标。无PHA刺激的C、E、G组CD25阳性细胞比例分别为(4.240±0.402)%、(3.047±0.332)%、(3.107±0.391)%,而PHA刺激的D、F、H组CD25阳性细胞比例分别为(32.713±1.343)%、(24.157±1.854)%、(51.243±0.91)%。C、E、G组CD25阳性细胞比例均低于D、F、H组(P0.01)。提示PHA刺激后T淋巴细胞活化明显。无PHA刺激的C、E、G组中,MSC接触/非接触培养、T细胞空白对照组CD25阳性细胞比例均无明显差异(P0.05)。提示MSC不会刺激共培养体系中的T细胞活化,PHA是T细胞活化的主要因素;无PHA刺激条件下,MSC对T细胞活化无明显影响。 PHA刺激的D、F、H组中,接触培养的D、非接触培养的F组CD25阳性细胞比例明显低于无MSC的H组(P0.01),而D组CD25阳性细胞比例高于F组(0.01P0.05)。提示MSC接触和非接触培养均对PHA刺激的T细胞活化有抑制作用,非接触培养较接触培养抑制作用明显,可能非接触培养对CD25阳性细胞的抑制更强。 6 MSC对调节性T细胞的影响 6.1 CD4CD25检测 CD4CD25双阳性是鉴别调节性T细胞的标记之一。无PHA刺激的C、E、G组CD4CD25双阳性细胞比例分别为(5.010±0.415)%、(3.403±0.282)%、(3.470±0.310)%,而PHA刺激的D、F、H组CD4CD25双阳性细胞比例分别为(45.623±2.624)%、(27.330±1.901)%、(25.103±1.835)%。C、E、G组CD4CD25双阳性细胞比例均低于D、F、H组(P0.01)。提示PHA刺激后调节T细胞比例增加。无PHA刺激的C、E、G组中,MSC接触/非接触培养、无MSC组中的T细胞CD4CD25双阳性细胞比例差异均不明显(P0.05),提示本实验中PHA刺激是T细胞调节T细胞亚群比例增高的原因之一,无PHA刺激条件下,MSC对调节性T细胞亚群的比例无影响。 PHA刺激的D、F、H组中,加MSC共培养的D组CD4CD25双阳性细胞比例明显高于非接触培养的F组和无MSC的H组(P0.01),而非接触培养的F组和无MSC的H组间差别不显著(P0.05)。PHA刺激后的活化细胞中,CD4CD25双阳性细胞比例增高,但MSC接触培养组增高更明显,提示MSC接触培养对PHA刺激的T细胞免疫表型变化有影响,可能上调CD4+CD25+调节性T细胞,而非接触培养上调作用不明显。 6.2 Foxp3mRNA表达检测 Foxp3是调节性T细胞的的特异性标记。无PHA刺激的C、E、G组Foxp3mRNA表达量分别为1.91±0.084、1.84±0.125、1.86±0.106,而PHA刺激的D、F、H组Foxp3mRNA表达量分别为2.58±0.089、2.35±0.044、2.09±0.1。C、E、G组Foxp3mRNA表达量低于D、F组(0.01P0.05),而与H无明显区别(P0.05)。提示单纯PHA刺激可能对Foxp3mRNA表达无影响。无PHA刺激的C、E、G组中,MSC接触/非接触培养、无MSC组中的T细胞Foxp3mRNA表达量均无明显差异(P0.05)。提示无PHA刺激条件下,MSC不影响T细胞Foxp3mRNA的表达。 PHA刺激的D、F、H中,接触培养的D组Foxp3mRNA表达量高于无MSC的H组(0.01P0.05)。而D组与非接触培养的F组、F组和H组间无显著差异(P0.05)。提示MSC接触培养能够使T细胞Foxp3mRNA表达上调,可能增加调节性T细胞比例,而非接触培养对Foxp3mRNA表达的影响不明显。结论: 1 MSCs接触和非接触培养均可明显抑制PHA刺激的T细胞增殖,接触培养的抑制作用强于非接触培养。 2 MSCs可能通过细胞间接触和分泌可溶性分子两种途径参与对T细胞增殖的抑制。 3 MSCs与T淋巴细胞接触培养可以上调CD4+CD25+调节性T细胞比例,而非接触培养上调不明显。 4 MSCs与T淋巴细胞接触培养可以上调T细胞Foxp3mRNA表达而非接触培养上调不明显。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】