PIG11诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨

发布时间：2018-05-18 02:08

  本文选题：PIG11 + miRNA　； 参考：《南华大学》2010年硕士论文

【摘要】： 目的:构建人PIG11的miRNA表达载体pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,建立低表达PIG11基因的HepG2细胞株,联合采用本课题组前期已建立的PIG11蛋白稳定高表达HepG2细胞株,探讨PIG11蛋白表达对HepG2细胞凋亡的影响,以及ROS和Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白表达在凋亡过程中的作用。阐明PIG11诱导细胞凋亡的分子机制。 方法:构建4个miRNA表达质粒,转化至感受态细菌DH5α挑取克隆测序。在脂质体2000的协助下转染HepG2细胞,经BSD筛选,获得稳定PIG11蛋白低表达的HepG2细胞。RT-PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白质水平鉴定4组载体转染HepG2细胞后PIG11的表达情况,从中选取干扰效果最好的1组作为PIG11蛋白低表达的HepG2细胞模型。故后续实验分组为HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞(空载体组细胞)、pLXSN-PIG11-HepG2细胞(PIG11高表达组细胞)、miR-PIG11-HepG2细胞(PIG11低表达组细胞)、miR-NC-HepG2细胞(干扰错义序列组细胞)。利用MTT法和平皿克隆形成实验检测细胞的生长情况;PI染色流式细胞术检测其凋亡效应;DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS,流式检测ROS水平的改变;Western Blot测定Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白的表达情况。 结果:成功构建4组人PIG11的miRNA表达载体pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,基因测序正确。转染后获得稳定细胞株,测定结果显示转染第4组干扰质粒的HepG2细胞PIG11 mRNA水平最低(p0.01),PIG11蛋白表达最低(p0.01)。实验显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞生长减慢(p0.01),miR-PIG11-HepG2细胞生长加快(p0.01),pLXSN-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞、HepG2细胞各组间生长差异无显著性。 结果显示:HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞的凋亡率分别为5.72%±0.81、5.34%±0.60、34.83%±2.29、1.34%±0.71、5.10%±0.40。pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率比其它各组增高(p0.01),miR-PIG11-HepG2细胞凋亡率降低(p0.01)。 HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞的ROS水平分别为5.52±0.97、4.92±0.71、15.71±0.82、2.39±0.22、5.12±0.15,pLXSN-PIG11-HepG2细胞ROS水平高于其余各组(p0.05),miR-PIG11-HepG2细胞ROS水平低于其余各组(p0.05)。使用ROS清除剂NAC后,各组细胞内的ROS水平降低,流式凋亡检测各组细胞凋亡显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率为16.2%±1.18较原来降低(p0.05),余各组细胞凋亡率变化不明显。使用MPTP抑制剂CsA后, pLXSN-PIG11-HepG2细胞组ROS水平降低至8.12±0.92(p0.05),余各组细胞变化不明显。 pLXSN-PIG11-HepG2细胞中Caspase3、Caspase9蛋白表达上调(p0.01),Survivin蛋白表达下调(p0.01),miR-PIG11 -HepG2细胞中Caspase3、Caspase9蛋白表达下调(p0.01),Survivin蛋白表达上调(p0.01)。 结论:建立了PIG11低表达的稳定细胞模型;PIG11高表达能抑制HepG2细胞生长和诱导其凋亡;PIG11诱导细胞凋亡与胞内ROS变化和Caspase3,9蛋白表达上调及Survivin蛋白表达下调有关。
[Abstract]:Objective: to construct a miRNA expression vector of human PIG11, pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR, to establish a HepG2 cell line with low expression of PIG11 gene, and to combine the stable and high expression of HepG2 cell lines with the previously established PIG11 protein in our group, and to explore the effect of PIG11 protein expression on the apoptosis of HepG2 cells, as well as ROS and Survivin, and the expression of the protein in the apoptosis of HepG2 cells. The role of PIG11 in inducing apoptosis is elucidated.
Methods: 4 miRNA expression plasmids were constructed and converted to DH5 alpha of receptive bacteria to clone and sequence. HepG2 cells were transfected under the assistance of liposome 2000. The expression of.RT-PCR and Western Blot, a HepG2 cell with low expression of PIG11 protein, was obtained, and the expression of PIG11 was identified from mRNA and protein levels, respectively, from mRNA and protein levels. The 1 groups with the best interference effect were selected as the HepG2 cell model with low expression of PIG11 protein, so the follow-up experiments were divided into HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells (unloaded group cells), pLXSN-PIG11-HepG2 cells (PIG11 high expression group cells), miR-PIG11-HepG2 cells (PIG11 low expression group cells), miR-NC-HepG2 cells (interfering missense sequence group fine) The cell growth of the cells was detected by the MTT method, and the apoptosis effect was detected by PI staining flow cytometry; the DCFH-DA fluorescence probe marked the intracellular ROS, the flow cytometry was used to detect the changes of ROS level; Western Blot was used to determine the expression of Survivin, Caspase3, Caspase9 protein.
Results: the miRNA expression vector pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR of 4 groups of human PIG11 was successfully constructed, and the gene was sequenced correctly. The stable cell line was obtained after transfection. The results showed that the PIG11 mRNA level of HepG2 cells transfected with fourth groups of plasmids was the lowest (P0.01), and the expression of PIG11 protein was the lowest (P0.01). The experiment showed that pLXSN-PIG11-HepG2 cell growth slowed (P0.01), The growth of R-PIG11-HepG2 cells was accelerated (P0.01), but there was no significant difference in the growth of pLXSN-HepG2 cells, miR-NC-HepG2 cells and HepG2 cells.
The results showed that the apoptosis rates of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.72% + 0.81,5.34% + 0.60,34.83% + 2.29,1.34% + 0.71,5.10% + 0.40.pLXSN-PIG11-HepG2 cells (P0.01), and the apoptosis rate of miR-PIG11-HepG2 cells decreased.
The ROS levels of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.52 + 0.97,4.92 + 0.71,15.71 + 0.82,2.39 + 0.22,5.12 + 0.15 respectively. PLXSN-PIG11-HepG2 cell ROS level was higher than that of the rest of the other groups. After the removal of NAC, the level of ROS in each group decreased. Apoptosis in each group showed that the apoptosis rate of pLXSN-PIG11-HepG2 cells was 16.2% + 1.18 than that of the original (P0.05), and the apoptosis rate of the remaining groups was not obvious. After CsA, the ROS level of the pLXSN-PIG11-HepG2 cell group decreased to 8.12 + 0.92 (P0.05), and the remaining groups were fine. The change of cell was not obvious.
In pLXSN-PIG11-HepG2 cells, the expression of Caspase3, Caspase9 protein was up regulated (P0.01), the expression of Survivin protein was downregulated (P0.01), Caspase3 in miR-PIG11 -HepG2 cells, down regulation of Caspase9 protein expression (P0.01), and up regulation of Survivin protein expression.
Conclusion: a stable cell model of low expression of PIG11 is established. High expression of PIG11 can inhibit the growth and induce apoptosis of HepG2 cells. PIG11 induced apoptosis is related to the changes in intracellular ROS, up regulation of Caspase3,9 protein expression and down regulation of the expression of Survivin protein.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

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