乙型肝炎病毒HBx蛋白的表达纯化及全基因组蛋白与宿主蛋白之间相互作用组模型的建立

发布时间：2018-05-27 15:36

本文选题：乙型肝炎 + 病毒　；参考：《第三军医大学》2008年博士论文

【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是导致肝细胞癌(HCC)发生的主要原因之一,而HBV相关的HCC排名十大癌症之一。在目前,全世界HBV慢性感染患者有两亿人,因此,HBV对人类的健康仍然是严重的威胁。尽管HBV相关肝癌的致病机理仍然不清楚,但有证据表明,HBx蛋白在HCC的发生和发展过程中有重要的作用。HBx蛋白是一种多功能的调节因子,它直接或间接地通过与宿主蛋白的相互作用参与调节转录、信号传导、细胞周期、蛋白降解、细胞凋亡和遗传稳定。 HBV的HBx基因编码154个氨基酸,大小为17KD。这些氨基酸残基中的九个半胱氨酸残基对HBx蛋白的结构具有十分重要的作用,前八个半胱氨酸残基形成四对二硫键,分别是Cys7和Cys78,Cys17和Cys115,Cys61和Cys137,Cys69和Cys143,而Cys148是游离的。每个半胱氨酸残基与其后面的第四个半胱氨酸残基形成二硫键而最后一个半胱氨酸残基又是游离的,这样的特殊结构可能是导致复性后HBx蛋白在溶液中存在多态性的原因。在用大肠杆菌表达完整的HBx蛋白或截断的HBx蛋白时,得到的目的蛋白总是以包涵体的形式存在,后期纯化还需要变性和复性,这对HBx蛋白的天然结构产生了一定的影响。但是在使用大肠杆菌表达出来的经过变性复性的HBx蛋白做功能试验时,它仍然具有与RNA和人的P53蛋白结合的活性。这说明了大肠杆菌表达出来的HBx蛋白在一级结构上是完全正确的并具有HBx蛋白在细胞中的一些功能。在用昆虫杆状病毒表达系统表达HBx蛋白时,它在昆虫细胞中有两种存在状态,一种是微量的可溶性状态,一种是大量的聚集状态。在后期的表达纯化时,也涉及到了变性和复性,而在使用核磁共振验证HBx蛋白的二硫键是否正确折叠时,发现复性的HBx蛋白只有三对二硫键。因此,不论是用大肠杆菌表达系统还是用昆虫杆状病毒表达系统,存在的主要问题就是要能大规模表达出正确折叠的可溶性的HBx蛋白。为了能表达出可溶性的HBx蛋白,选择合适的表达质粒和宿主菌是成功的关键。在大肠杆菌和杆状病毒系统中使用GST和His标签融合到HBx的N端,表达出来的融合蛋白均是包涵体。我们选择了pET32a、pQE30和pMAL-c2x质粒作为表达质粒,其中在pMAL-c2x质粒上携带了麦芽糖结合蛋白(MBP)标签,pQE30质粒上携带了His标签和pET32A质粒携带了Trx、S和His标签。我们把这些构建了HBx基因的表达质粒分别在BL21(DE3)、TB1和JM109菌株中表达,预实验结果显示,只有携带HBx基因的pMAL-c2x质粒在JM109菌株表达的融合蛋白才是可溶的,而在BL21(DE3)菌株中部分融合蛋白是可溶的,在TB1菌株中不表达。这说明了MBP标签对HBx蛋白在细菌中表达的可溶性有一定的帮助。我们培养了15L的细菌,收集菌体后超声破碎,然后通过离心,上亲和树脂柱和离子交换柱,纯化出了60mg的融合蛋白。通过Factor Xa蛋白酶酶切,48小时后,发现溶液中有类似胶体的沉淀。通过分析发现HBx蛋白的PI为8.6,MBP的PI为4.9,MBP-HBx蛋白的PI为6.1,而溶液的PH为8.0,因此我们通过PH值调节,发现当溶液PH值为10.0时,白色胶状体消失,溶液变澄清。为了能增加蛋白的可溶性,我们在透析酶切产物时加入了1M Urea和0.05% SDS,然后再通过凝胶柱来分离这三个蛋白。通过凝胶柱分离后,目的蛋白HBx的浓度为0.5mg/ml。这为研究HBx蛋白的结构奠定了坚实的基础。 HBV感染在全世界是肝脏癌症发生的最普通的原因,它主要通过体液传播、性传播和母婴传播。HBV是一种双链DNA病毒,属于肝DNA病毒属,能引起急性和慢性肝炎。HBV基因组由全长为3.2kb的正链与一条不完全的负链组成不完全闭合的双链环状DNA,编码四条重叠的mRNA分子,大小分别为3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb,然后在细胞质中编码七种病毒蛋白,分别是多聚酶(P)、S抗原、preS1、preS2、C抗原、preC、e抗原。其中3.5kb的转录产物翻译形成多聚酶、核心蛋白(C)和前核心蛋白(preC),并作为前基因组的RNA模板,反转录后作为病毒基因组复制的第一步。2.4kb和2.1kb转录产物产生大、中、小三个包装蛋白,分别为preS1、preS2、S抗原。这三种蛋白具有一个共同的C端,只是在N端的氨基酸序列延长的长短不同。0.7kb的转录产物产生X蛋白,它具有转录激活的功能。 HBV在感染、复制和增殖期间通过病毒蛋白与宿主蛋白相互作用不断的适应和调节宿主的环境,达到在宿主细胞生存的目的。通过研究病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的数据,我们可以全面分析病毒的生命周期,同时有可能发现一些重要的相互作用,为将来的药物治疗提供一个新的靶标。基于这个目的,我们利用TAP标签技术来研究HBV基因组蛋白与肝细胞HepG2蛋白的相互作用。首先,我们构建了HBV基因组质粒pCR-XL-TOPO-HBV,然后以此为模板,分别扩增了P、S、preS1、preS2、C、preC和e基因。其次,我们构建了在C端携带TAP标签和N端携带生物素标签的逆转录病毒载体pBT-TAP-IRES-BIRA,并以此载体作为对照载体。最后,我们把扩增的七个基因分别插入到pBT-TAP-IRES-BIRA质粒的SnaB I位点,构建了pBTIB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-X、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2。为了减少标签蛋白对靶蛋白结构和功能的影响,我们在SnaB I位点两边加上了柔性氨基酸序列GSGGSG。我们通过把pBT-TAP-IRES-BIRA、pBTIB-X、pBTIB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2转入PT67细胞包装病毒来感染HepG2,用3.5μg/ml嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株,然后通过PT67细胞包装病毒感染HepG2细胞,用50μg/ml的匀霉素和1μg/ml的嘌呤霉素筛选并获得稳定细胞株。然后我们用TAP标签的抗体通过Westernblotting来鉴定目的蛋白的表达。最后,我们获得了分别稳定表达P、S、preS1、preS2、C、preC和e蛋白的HepG2细胞株。这为我们进一步研究HBV病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用组打下了坚实的基础。
[Abstract]:Chronic infection of hepatitis B virus ( HBV ) is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma ( HCC ) , while HBV - related HCC is one of the top ten cancers . At present , HBV is a serious threat to human health . Although the pathogenesis of HBV - related liver cancer remains unclear , there is evidence that HBx protein plays an important role in the genesis and development of HCC . HBx protein is a multifunctional regulatory factor that regulates transcription , signaling , cell cycle , protein degradation , apoptosis and genetic stability directly or indirectly through interaction with host proteins .

The HBx protein expressed by E . coli has two disulfide bonds , Cys17 and Cys137 , Cys69 and Cys143 , and Cys148 is free .

We selected pET32a , pQE30 and pMAL - c2x plasmids as expression plasmids .

HBV is a double - stranded DNA virus , which is a double - stranded DNA virus . It is a double - stranded DNA virus . It is a double - stranded DNA virus which can cause acute and chronic hepatitis .

In order to reduce the effects of label protein on the structure and function of the target protein , we constructed the recombinant plasmid pCR - XL - TOPO- BIRA , pBTIB - P , pBTIB - preC , pBTIB - preS1 , pBTIB - preS2 .

HepG2 cells were infected with pBT - TAP , pBTIB - P , pBTIB - X , pBTIB - P , pBTIB - S , pBTIB - C , pBTIB - preC , pBTIB - preS1 , pBTIB - preS2 and pTIB - preS1 , pBTIB - preS2 were transferred to PT67 cell packaging virus to infect HepG2 cells .
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

【共引文献】