肺炎链球菌HMG-CoA合成酶和还原酶基因克隆表达及功能研究

发布时间：2018-07-06 20:53

  本文选题：肺炎链球菌 + HMGS　； 参考：《华中师范大学》2008年博士论文

【摘要】： 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起脑膜炎、菌血症、肺炎等疾病的主要致病菌,近年来由于环境污染和抗生素的乱用而造成多药抗性的肺炎链球菌菌株逐年增加,抗性逐年增强。深入研究肺炎链球菌等革兰氏阳性球菌致病机理和代谢过程十分重要,将为新的抗生素研发提供新的作用位点或靶标。现代微生物学研究表明甲羟戊酸的代谢过程是肺炎链球菌等革兰氏阳性球菌生长所必需的,甲羟戊酸途径(mevalonate pathway)是一种潜在的药物作用靶标。我们选择HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶作为靶酶,研究其抑制剂影响肺炎链球菌正常生理代谢的作用机理,从而阻止病原菌赖以生存的甲羟戊酸代谢途径。 本研究以肺炎链球菌为材料,采用基因工程技术克隆表达了肺炎链球菌HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)基因,进行了动力学特性和功能研究。同时,构建了肺炎链球菌HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶三维空间结构模型,利用筛选抑制剂生物活性检测方法对用分子对接技术和网格计算技术在化合物数据库中进行高通量虚拟筛选出的抗生素先导化合物进行了实际筛选。本文主要得到以下研究结果: 1.从肺炎链球菌基因组DNA中克隆了HMGS基因,基因序列分析表明:该基因与文献中报道的肺炎链球菌HMGS基因(No.AF290098)相比较有98.5%的同源性,存在18个核苷酸的差异,其中有2个核苷酸的不同导致编码的氨基酸改变,分别是Asn259→Ser,Ala349→Val。将HMGS基因亚克隆到pET-28未能正常表达,分析发现在第226核苷酸处A突变成T,导致形成了终止密码子。通过对T226进行反突变,构建重组表达载体pET-HMGSm并成功表达。该基因编码蛋白由398个氨基酸组成。 2.通过优化重组HMGS的表达条什,在18℃0.4mM IPTG诱导表达4h,利用Ni-NTA层析柱分离纯化得到了46kDa特异性蛋白(重组HMGS)。重组肺炎链球菌HMGS酶学特性研究发现:该酶最适pH 9.75,最适MgCl_2浓度为10mM/mL,最适温度37℃。粗酶提取物的比活为0.76μmol/min/mg,分离纯化后比活为3.24μmol/min/mg,比活提高4.26倍。动力学分析表明:该酶Vmax和Km分别为4.69μmol/min/mg和Km为213μM。 3.从肺炎链球菌基因组DNA中克隆了HMGR基因,该基因与文献中报道的肺炎链球菌HMGR基因(No.AF290098)相比较有99.9%的同源性,存在7个核苷酸的差异,其中有3个核苷酸的不同引起编码氨基酸的改变,分别是Glu44→Val,Asn46→Asp,Gly72→Glu。该基因编码蛋白由424个氨基酸组成。构建了克隆重组表达载体pET-HMGR,在30℃经1mM IPTG诱导表达,Ni-NTA层析柱分离纯化后获得了47kDa的特异性蛋白。动力学分析表明肺炎链球菌HMGR的最适pH 6.5,最适温度37℃。粗酶提取物的比活为11.22μmol/min/mg,分离纯化后比活为31.98μmol/min/mg,比活捉高2.8倍。在37℃,pH 6.5时的Vmax和Km分别为62.1μmol/min/mg和260μM。用表达纯化后的HMGR蛋白免疫新西兰大白兔,提取抗血清,ELISA检测其效价为1:320,000,Western杂交进一步证明HMGR具有较高的免疫学活性。 4.以粪肠球菌HMGS和假单胞菌HMGR晶体结构为模板,通过SYBYL7.0软件,成功地构建了链球菌HMGS利HMGR的同源模建。采用计算机分析三维结构,用同源模建的方法寻找结构类似物来研究新药的开发是一个新的领域。本研究分析了肺炎链球菌HMGS和HMGR的三维结构,根据其同源模建和三维结构,利用分子对接技术和网格计算技术在化合物数据库中进行高通量虚拟筛选竞争性抑制剂。 5.建立了采用重组肺炎链球菌HMGR筛选抑制剂苗头化合物的生物活性检测方法。对利用分子对接技术和网格计算技术在化合物数据库中进行高通量虚拟筛选出的30种苗头化合物进行了实际筛选。初步分析结果表明:在候选的30种苗头化合物中,筛选到一种比传统的竞争性抑制剂洛伐它汀具有更佳抑制效果的10号抑制剂,其抑制常数Ki为76μM,而洛伐它汀的抑制常数Ki为353μM。筛选到的该化合物通过进一步的药理、毒理、临床研究,有望研发成为治疗革兰氏阳性球菌的新药物。 6.洛伐它汀是HMGR的竞争性抑制剂,对肺炎链球菌HMGR具有一定的抑制效果,而洛伐它汀对HMGS几乎没有抑制作用。重组HMGR筛选苗头化合物使用的底物HMG-CoA费用昂贵,极大地限制了实际筛选,通过克隆表达的重组HMGS酶促反应的产物代替HMG-CoA进行苗头化合物筛选效果较好。重组HMGS酶促反应的产物可以对大量候选的苗头化合物进行初筛,可降低筛选成本,有利于寻找新型高效抑制先导化合物,为研发可用于治疗肺炎、脑膜炎、败血症、菌血症等疾病的新型抗生素先导化合物奠定基础。新型高效抗生素药物一旦研发成功,将有着良好的应用前景。
[Abstract]:Streptococcus pneumoniae ( Streptococcus pneumoniae ) is the main pathogenic bacterium causing meningitis , bacteraemia , pneumonia and other diseases . In recent years , the strain of Streptococcus pneumoniae caused by the disorder of environmental pollution and antibiotics has been increasing year by year . The pathogenesis and metabolic process of Gram - positive cocci , such as Streptococcus pneumoniae , is important for the development of new antibiotics . The study of modern microbiology shows that mevalonate pathway is a potential drug target . We choose HMG - CoA synthetase and HMG - CoA reductase as target enzyme to study the mechanism of the inhibitor on the normal physiological metabolism of Streptococcus pneumoniae , thus preventing the metabolic pathway of mevalonate which is dependent on the survival of pathogenic bacteria .



A three - dimensional structure model of Streptococcus pneumoniae HMG - CoA synthetase ( HMGS ) and HMG - CoA reductase ( HMGR ) gene was cloned and expressed by genetic engineering technique . The three - dimensional spatial structure model of Streptococcus pneumoniae HMG - CoA synthetase and HMG - CoA reductase was constructed .



1 . The HMGS gene was cloned from the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae . The gene sequence analysis showed that the gene was 98 . 5 % homologous to the reported Streptococcus pneumoniae HMGS gene ( No . AF290098 ) , and there were 18 nucleotides , which resulted in the alteration of the encoded amino acids , which were Asn259 鈫，

本文编号：2104053