淋病奈瑟菌NspA-LTB核酸疫苗免疫活性研究

发布时间：2018-07-10 10:08

  本文选题：淋球菌 + 奈瑟菌表面蛋白A　； 参考：《南华大学》2009年硕士论文

【摘要】：【目的】利用已构建的真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,观察其在小鼠鼻粘膜细胞内的表达,检测其所诱发的特异性体液免疫应答(尤其是粘膜免疫应答)和细胞免疫应答水平,为研制高效的淋球菌核酸疫苗提供实验依据。 【方法】①真核质粒的鉴定。提取真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA行PCR及双酶切鉴定。②观察真核重组质粒在小鼠鼻粘膜细胞内的表达。真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w取小鼠鼻粘膜采用免疫组织化学法检测NspA、LTB、LTB-NspA蛋白的表达。③nspA-ltB核酸疫苗免疫活性的检测。取真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和PBS组,共免疫3次。每次免疫前一天及末次免疫后2w经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平;同时用PBS冲洗小鼠生殖道,收集其生殖道冲洗液,间接ELISA法检测冲洗液中NspA特异性SIgA抗体水平。末次免疫后2w取小鼠脾淋巴细胞于37℃5%CO2培养箱中培养后,MTT法检测淋巴细胞增殖水平,间接ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。 【结果】真核重组质粒pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,经鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2w采用免疫组织化学法检测到重组蛋白在小鼠鼻粘膜细胞内表达;实验组pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA小鼠生殖道冲洗液中NspA特异性SIgA水平明显高于对照组(P0.01),且含粘膜佐剂的pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组较单基因pcDNA3.1(-)/nspA组高(P0.05)。实验组小鼠血清中NspA特异性IgG抗体明显高于对照组(P0.01);但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组与单基因pcDNA3.1(-)nspA组比较,特异性IgG抗体水平差异不显著(P0.05)。实验组小鼠脾淋巴细胞经特异性NspA抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显高于对照组(P0.01) [pcDNA3.1(-)/nspA组达153.79±19.03pg/mL,pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组达160.56±25.67pg/mL,与pcDNA3.1(-)/ ltB组(60.56±11.45pg/mL) ,空质粒组pcDNA3.1(-) (40.34±9.89pg/mL)和PBS组(25.75±6.12pg/mL)之间有显著性差异(P0.01),两实验组间IFN-γ含量差异不显著(P0.05)。MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平, pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组和pcDNA3.1(-)/nspA组小鼠脾淋巴细胞经特异性NspA抗原刺激后,刺激指数分别为(1.653±0.32)和(1.598±0.25),明显高于对照组[pcDNA3.1(-)/ltB组(1.122±0.21),空质粒组pcDNA3.1(-) (1.134±0.17)和PBS组(1.014±0.10) (P0.01)],两实验组间刺激指数差异不显著(P0.05)。 【结论】 1、用构建好的pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA核酸疫苗,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答(尤其是粘膜免疫应答)和细胞免疫应答。 2、真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA,通过鼻饲途径免疫BALB/c小鼠,能在鼻粘膜细胞内获得表达。 3、证实了LTB作为粘膜佐剂与NspA融合,通过鼻饲免疫后能提高NspA诱导的特异性SIgA水平。
[Abstract]:[Objective] to use the constructed eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA to immunization BALB/c mice through nasal feeding, to observe the expression in the murine nasal mucosa cells, and to detect the specific humoral immune response (especially the mucosal immune response) and the cellular immune response. To provide an experimental basis for efficient nucleic acid vaccine of Neisseria gonorrhoeae.
(method) identification of eukaryotic plasmid. Extract eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA PCR and double enzyme digestion. (2) observe the expression of eukaryotic recombinant plasmid in murine nasal mucosa cells. Eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) / ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-), through nasal feeding pathway exemption The immunization of NspA, LTB, LTB-NspA protein in the nasal mucosa of the infected BALB/c mice was detected by 2W after the last immunization. The immunoactivity of nspA-ltB nucleic acid vaccine was detected. The eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA nasogastric immune BALB/c mice were taken, and the control group was also set up for pcDNA3.1 (-) and group. They were immunized 3 times. After each immunization, 2W was collected from the tail vein of mice one day before and after the last immunization. Serum was isolated from the tail vein of mice. The serum level of NspA specific IgG antibody in serum was detected by indirect ELISA. Meanwhile, the reproductive tract of mice was washed with PBS, the reproductive tract irrigation fluid was collected, and the specific SIgA antibody level of NspA in the liquid was detected by indirect ELISA method. The 2W was taken after the last immunization. After the culture of rat spleen lymphocytes in 37 5%CO2 incubator, the proliferation level of lymphocytes was detected by MTT, and the IFN- gamma content in spleen supernatant was detected by indirect ELISA.
[results] the eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA were immune to BALB/c mice through nasal feeding, and the recombinant protein was detected by immunohistochemistry in the nasal mucosa of mice after the last immunization, and the experimental group pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA mice reproductive tract irrigate. The level of heterosexual SIgA was significantly higher than that of the control group (P0.01), and the pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group containing the mucosal adjuvant was higher than that of the single gene pcDNA3.1 (-) /nspA group (P0.05). The serum NspA specific IgG antibody in the experimental group was significantly higher than that of the control group (P0.01), but the specific antibody level difference was compared with the pcDNA3.1 (-) / ltB-nspA group and the single gene (-) group It was not significant (P0.05). The content of IFN- gamma in the culture supernatant was significantly higher than that of the control group (P0.01) [pcDNA3.1 (-) /nspA group (P0.01) 153.79 + 19.03pg/mL, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group 160.56 + 25.67pg/mL, pcDNA3.1 (-) / ltB group (60.56 +), and empty plasmid group (40.34 + 9.). 89pg/mL) and PBS group (25.75 + 6.12pg/mL) had significant difference (P0.01). The difference of IFN- gamma content between the two experimental groups was not significant (P0.05).MTT method to detect the proliferation of splenic lymphocyte. The stimulus index of pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA group and pcDNA3.1 (-) /nspA group of spleen lymphocyte was (1.653 + 0.32) and (1.598) after specific NspA antigen stimulation. + 0.25), significantly higher than the control group [pcDNA3.1 (-) /ltB group (1.122 + 0.21), empty plasmid group pcDNA3.1 (-) (1.134 + 0.17) and PBS group (1.014 + 0.10) (P0.01)], two experimental group stimulation index difference was not significant (P0.05).
[Conclusion]
1, using the constructed pcDNA3.1 (-) /nspA, pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA nucleic acid vaccine and immunization of BALB/c mice through the nasal feeding pathway, it can induce a strong specific humoral immune response (especially the mucosal immune response) and cellular immune response in mice.
2, eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) /ltB, pcDNA3.1 (-) /nspA and pcDNA3.1 (-) /ltB-nspA can immunized BALB/c mice through nasal feeding, and can be expressed in nasal mucosa cells.
3, it is confirmed that LTB can be used as a mucosal adjuvant and NspA fusion. After nasal feeding immunization, the level of specific SIgA induced by NspA can be increased.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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