犬小孢子菌SSH文库中差异基因的研究

发布时间：2018-07-13 15:20

【摘要】： 目的:犬小孢子菌是一种可侵犯人和动物皮肤、毛发、甲的真菌,其突出的生物学特点是嗜角质性,引起皮肤的浅部感染。它不是机会性致病菌,而是真正感染健康机体的致病菌。随着人们生活水平的提高,猫狗等宠物与人类接触的增加导致犬小孢子菌病逐年增加,特别是犬小孢子菌所致脓癣例数急剧增加。有证据显示分泌性活性蛋白酶在它们侵入性方面扮演了重要的角色,然而除蛋白酶以外的因子与头癣的相关性及在头癣中的发病机制尚无报道。先期试验已经从不同的诱导培养基中培养出犬小孢子菌,即儿童头皮组织诱导培养基菌株(tester);儿童光滑皮肤组织诱导培养基菌株(driver1);成人头皮组织诱导培养基菌株( driver2 ),利用抑制消减杂交技术( suppression subtractive hybridization ,SSH)构建了tester与driver1(SSH1文库)和tester与driver2(SSH2文库)的两个正向差异基因文库,并进行了文库克隆。本实验就差异文库的进一步筛选及对获得的差异基因进行功能及定量分析,为下一步探讨差异基因在头癣发病机制中的作用及在豚鼠感染模型中的研究做出一些探索。 方法: 1.利用斑点杂交对SSH1和SSH2文库(均为250个克隆)进行阳性克隆筛选。 2.对筛选的阳性克隆测序并利用BLAST在GenBank和蛋白质直系同源簇数据库(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)上进行同源序列分析。 3.利用实时PCR对差异基因进行定量检测。 结果: 1.斑点杂交后共得到110个阳性克隆。 2.阳性克隆的测序:SSH1文库得到了62个有效序列,SSH2文库得到了44个有效序列。数据库的分析:去除混杂基因(与人基因同源性98%,线性分数=200;与真菌基因线性分数40)后,共得到13个EST,其中5个为未知新序列,可能代表了tester特异表达的新基因,8个找到了同源基因,其中6个具有功能分类。 3.实时PCR检测结果:SSH1文库中的FSH1和PQ-LRP基因在tester RNA池中的表达量分别为driver1 RNA池中表达量的44.6倍和117倍;SSH2文库中的P-GAL4和NADH1基因在tester RNA池中的表达量分别为driver2 RNA池中表达量的78.2倍和9.8倍。 结论: 1.在SSH1文库中筛选到5个同源基因:FSH1、PQ-LRP、multidrug resistance protein MDR、RING zinc finger protein和RING zinc finger protein, putative。在SSH2文库中筛选到3个同源基因:P-GAL4、NADH1和DNA-directed RNA polymerase I subunit。 2. FSH1和PQ-LRP基因在儿童头皮组织诱导培养基菌株中相对于儿童光滑皮肤组织诱导培养基菌株中的上调表达表明,这2个基因在犬小孢子菌感染头皮组织中具有重要作用,可以作为犬小孢子菌致头癣的分子机理继续研究。 3. P-GAL4和NADH1基因在儿童头皮组织诱导培养基菌株中相对于成人头皮组织诱导培养基菌株中的上调表达显示,这2个基因可能与犬小孢子菌更易于感染儿童有关,可以作为研究犬小孢子菌致病性的候选基因。
[Abstract]:Objective: Microsporum canis is a fungus that invades human and animal skin, hair, and armour. Its prominent biological characteristics are the horniness and the superficial infection of the skin. It is not an opportunistic pathogen, but a pathogenic bacteria that really infects the healthy body. With the improvement of people's living water, the pet and dog and other pets are in contact with humans. Microsporosis in dogs has increased year by year, especially the number of cases of psoriasis caused by Microsporum canis, and there is evidence that secretory protease plays an important role in their invasiveness. However, there is no report on the correlation between the protease except for the tinea capitis and the pathogenesis in the tinea capitis. The culture medium of canine microspore was cultured in the same inducible medium, that is, the culture medium strain (tester) of the children's scalp tissue, the culture medium strain (Driver1) of the smooth skin tissue of children, the culture medium strain (Driver2) of the adult scalp tissue, and the construction of tester with the suppression subtractive hybridization technique (suppression subtractive hybridization, SSH). Two positive differential gene libraries of Driver1 (SSH1 Library) and tester and Driver2 (SSH2 Library) were cloned. The further screening of the differential library and the functional and quantitative analysis of the differential genes were carried out in this experiment to explore the role of the differential gene in the pathogenesis of tinea pedis and the infection model of guinea pig in the next step. Research makes some explorations.
Method:
1. dot blot was used to screen positive clones of SSH1 and SSH2 libraries (all 250 clones).
2. the screened positive clones were sequenced and BLAST was used to analyze the homologous sequences on the GenBank and protein direct homologous cluster database (Clusters of Orthologous Groups of proteins, COG).
3. quantitative detection of differentially expressed genes by real-time PCR.
Result:
110 positive clones were obtained after 1. dot blot hybridization.
2. positive clones were sequenced: the SSH1 library obtained 62 effective sequences, and the SSH2 library obtained 44 effective sequences. The analysis of the database: removing the confounding gene (the homology 98%, linear fraction =200, and the linear fraction 40 of the fungal gene), 13 EST were obtained, 5 of which were unknown new sequences, which may represent a new tester specific expression. 8 of the genes found homologous genes, 6 of which have functional taxonomy.
3. the results of real-time PCR detection: the expression of FSH1 and PQ-LRP genes in the tester RNA pool is 44.6 times and 117 times in the Driver1 RNA pool, respectively. The expression of P-GAL4 and NADH1 genes in the SSH2 library is 78.2 times and 9.8 times that of the Driver1 RNA pool.
Conclusion:
1. the 5 homologous genes were screened in the SSH1 Library: FSH1, PQ-LRP, multidrug resistance protein MDR, RING zinc finger protein and RING, and 3 homologous genes were screened in the library.
The up-regulated expression of 2. FSH1 and PQ-LRP genes in the culture medium strain of children's scalp tissue induced culture medium showed that these 2 genes play an important role in the infection of the scalp tissue of Microsporum canis, which can be used as the molecular mechanism of tinea capitis caused by Microsporum canis.
The up-regulated expression of 3. P-GAL4 and NADH1 genes in the strains of adult scalp induced culture medium strains in children's scalp induced medium showed that these 2 genes may be more likely to be associated with the infection of children with Microspora canis, and can be used as a candidate gene for the study of the pathogenicity of microspore microspore.
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

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本文编号：2119860