伏马菌素对GES-1细胞HLA-Ⅰ类分子及其抗原加工转运相关分子LMP2、TAP1影响的实验研究

发布时间：2018-07-18 14:06

【摘要】： 目的:人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-I类分子分布于所有有核细胞表面,由一条α重链(被糖基化的)和一条β2-微球蛋白(β2m)轻链非共价结合而成。HLA-I类分子可与内源性抗原(如细胞感染病毒后产生病毒蛋白或基因突变产生的突变蛋白)肽结合,并将其提呈给CD8+ T细胞,诱发特异性细胞杀伤效应,在机体抗病毒感染、监视和清除体内突变细胞过程中起着重要的作用。其中,HLA-A、B、C是经典的HLA-I类分子。多功能蛋白酶2(large multifunctional protease, LMP2)是组成细胞内蛋白酶体(proteasome)的亚基之一,能够将内源性抗原降解成多肽,后者与转运相关蛋白(transporter associated protein,TAP)相结合。TAP1是组成TAP的亚单位之一,可以将蛋白酶体产生的多肽转运至内质网腔中使之与新合成的HLA-I类分子相结合,进而呈递至细胞表面供T细胞识别。HLA-I类分子的正常表达以及内源性抗原肽的加工和转运是维持机体免疫监视功能的重要环节。有研究表明,一些致癌性的环境因素可降低正常细胞表面HLA-I类分子的表达,使细胞逃避免疫监视作用,为其发生恶性转化提供可能。伏马菌素B1(FumonisinB1,FB1)是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)产生的代谢物,主要污染玉米、小麦、大米及豆类等粮食作物。FB1可以引起马脑白质软化综合征、猪肺水肿和鼠肝肾损伤,且其促癌性和致癌性已在大鼠中得到证实。另外,流行病学调查资料显示,FB1可能与食管癌的发生有密切关系。而目前对FB1的研究多集中在检测方法、对动物及其细胞株的毒理学实验上,而对于人体免疫功能影响的研究国内外鲜有报道。本研究拟通过观察不同剂量和不同作用时间的FB1对体外培养的人胃粘膜上皮GES-1细胞中经典的HLA-I类分子(HLA-A,B,C)、β2m、LMP2和TAP1基因在mRNA和蛋白水平表达的影响,以期揭示其对胃上皮细胞内源性抗原加工、转运及表达的作用及其机制,为某些消化道肿瘤的治疗和预防提供依据。方法:及处理用含10%胎牛血清,105 U/L青霉素,100mg/L链霉素的DMEM培养基于37℃,5% CO2条件温箱中体外培养正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1细胞,细胞呈贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为对照组和处理组。在剂量和时间效应实验中,FB1作用剂量和时间的设计以Neera等人为参考并结合预实验结果,在量效研究中,处理组加入FB1,使其终浓度分别为5,10和20μΜ,作用时间均为24h;在时效研究中,根据量效研究结果选择20μΜFB1为处理浓度,作用时间分别为2,6,12,24,36,48和72h,每个时间点均设置相应的对照组。经FB1作用后,常规细胞刮匙刮除并离心收集细胞。 2反转录-PCR(RT-PCR)检测mRNA的表达 2.1细胞总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。 2.2 RT-PCR方法应用RT-PCR方法检测不同剂量和不同作用时间的FB1对GES-1细胞HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1 mRNA表达的影响。采用凝胶分析软件(BIO-LD)进行定量分析,各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值来表示目的基因的相对表达量。 3蛋白免疫印迹(Western blot)检测蛋白的表达 3.1细胞总蛋白的提取和定量应用预冷的细胞胞膜裂解液和胞浆裂解液分别加入收集的细胞中,以提取细胞的胞膜蛋白和总蛋白。将提取的蛋白应用紫外分光光度计进行定量。 3.2 Western blot方法提取的细胞总蛋白,应用Western blot方法检测不同剂量和不同作用时间的FB1对GES-1细胞HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1蛋白表达水平的影响。所检测的四种蛋白的分子量分别为43～45 kD、12KD、21～24KD和64KD。 4免疫细胞化学(ICC)染色(SP法) 细胞爬片后,检测不同剂量的FB1(0, 5, 10,20μM )处理后GES-1细胞中HLA-A,B,C、β2m、LMP2和TAP1的表达情况。 5统计所有数据采用SPSS13.0软件进行Pearson相关分析与单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),结果用x±s表示。结果: 1 FB1对GES-1细胞HLA-I类分子表达的影响 1.1 FB1对GES-1细胞HLA-I类分子重链(HLA-A,B,C)表达的影响 1.1.1 FB1对GES-1细胞HLA-I类分子重链HLA-A,B,C表达的量效作用 RT-PCR结果显示:不同浓度的FB1处理后,HLA-A mRNA的相对表达量随作用浓度的升高逐渐降低(r=-0.767,P0.01)。中、高剂量(10μM和20μM)的FB1处理组中,HLA-B mRNA的相对表达量均明显低于对照组水平(P0.05),而低剂量组(5μM)表达水平未见明显改变(P0.05)。各浓度处理组HLA-C mRNA相对表达量与对照组水平相比均未见显著性差异(P0.05)。 Western blot检测结果显示:不同浓度的FB1处理后,HLA-A,B,C的相对表达量随作用浓度的升高逐渐降低(r=-0.848, P0.01)。 ICC染色结果也显示:FB1处理组HLA-A,B,C蛋白的相对表达量与对照组水平相比均明显降低(P0.05)。 1.1.2 FB1对GES-1细胞HLA-A,B,C表达的时效作用RT-PCR结果显示:经20μM FB1作用不同时间后,在24、48、36和72h处理组中,HLA-A mRNA的相对表达量均明显低于各自的对照组水平(P0.05);而处理2、6和12h,与对照组水平相比均无显著性差异(P0.05)。其中,2-24h内,随处理时间延长,细胞中HLA-A mRNA的相对表达量逐渐降低(r=-0.792, P0.01);而在24-72h内随时间延长逐渐升高但二者间未见明显相关关系(r=0.334, P0.05)。 HLA-B mRNA的表达量仅在12、24和36h处理组中显著低于相应的对照组水平(P0.05)。在2-12内随作用时间延长而逐渐下降(r=-0.683, P0.01);在12-72h内随作用时间延长逐渐缓慢趋于升高但未见明显相关关系(r=0.182, P0.05)。在12、24和36h处理组中,HLA-B mRNA的相对表达量与相应的对照组水平相比均明显降低(P0.05)。在72h内,20μM FB1作用不同时间后,HLA-C mRNA的表达均未见明显差异(P0.05)。 Western blot检测结果显示:20μM的FB1分别作用12、24、36、48和72h时,HLA-A,B,C蛋白的表达均明显低于相应的对照组水平(P0.05);而作用2和6h时对HLA-A,B,C蛋白的表达无明显影响(P0.05)。另外,HLA-A,B,C蛋白的相对表达量在2-24h内随作用时间延长呈逐渐下降趋势(r=-0.770, P0.01),随后在24-72h内随时间延长逐渐升高(r=0.976, P0.01)。 1.2 FB1对GES-1细胞β2m表达的影响 1.2.1 FB1对GES-1细胞β2m表达的量效作用 RT-PCR结果显示:各浓度处理组β2m mRNA的相对表达量改变与对照组水平相比均无明显统计学意义(P0.05)。蛋白水平上,Western blot及免疫细胞化学染色检测结果均显示FB1各剂量处理组β2m表达量与对照组水平相比均无显著性差异(P0.05)。 1.2.2 FB1对GES-1细胞β2m表达的时效作用 RT-PCR结果显示:在各时间段内β2m mRNA的相对表达量与对照组水平相比未见显著性差异(P0.05)。 Western blot检测结果显示:β2m蛋白的相对表达量较之相应的对照组水平未见明显差异(P0.05)。 2 FB1对GES-1细胞LMP2表达的影响 2.1 FB1对GES-1细胞LMP2表达的量效作用RT-PCR结果显示:中、高剂量(10μM和20μM)的FB1处理后,LMP2 mRNA的相对表达量均明显低于对照组水平(P0.05),而低剂量(5μM)组表达水平未见明显改变(P0.05)。 Western blot检测结果显示:FB1各剂量处理组LMP2的相对表达量与对照组水平相比均具有显著性差异(P0.05)并且随处理浓度的升高依次降低(r=-0.812, P0.01)。ICC染色结果也显示FB1各处理组LMP2阳性细胞百分数分别为与对照组水平相比均具有显著性差异(P0.01)。 2.2 FB1对GES-1细胞LMP2表达的时效作用 RT-PCR结果显示:20μM FB1分别作用12、24、36、48h,LMP2 mRNA的相对表达量均明显低于相应的对照组水平(P0.05);但2、6和72h处理组中LMP2 mRNA的表达量未见显著性差异(P0.05)。其中,在2-12h内随作用时间延长,FB1对LMP2 mRNA的相对表达量逐渐降低(r=-0.452, P0.05);随后在12-72h内LMP2 mRNA的相对表达量随作用时间延长逐渐升高(r=0.803, P0.01)。 Western blot检测结果显示:LMP2蛋白的相对表达量在12、24和36h时显著低于各自的对照组水平(P0.05),在2、6、48和72h时其表达量与各自的对照组水平相比未见显著性差异(P0.05)。LMP2蛋白的相对表达量在2-24h内随作用时间延长逐渐下降(r=-0.972, P0.01),在24-72h内逐渐升高但未见有明显相关关系(r=0.061, P0.05)。 3 FB1对GES-1细胞TAP1表达的影响 3.1 FB1对GES-1细胞TAP1表达的量效作用RT-PCR结果显示:不同浓度的FB1作用24h后,仅高浓度(20μM)处理组TAP1 mRNA与对照组水平相比显著降低(P0.01)。 Western blot检测结果显示:仅中、高浓度(10μM和20μM)FB1处理组TAP1相对表达量较之对照组具有显著性差异(P0.05);ICC染色结果对TAP1蛋白表达的检测结果亦显示10μM和20μM处理组具有显著性差异(P0.01)。 3.2 FB1对GES-1细胞TAP1表达的时效作用RT-PCR结果显示:TAP1 mRNA的相对表达量在12、24、36和48h时均显著低于相应的对照组水平(P0.05),但在2、6和72h时二者未见显著性差异(P0.05)。经不同作用时间后,TAP1 mRNA的相对表达量在2-12h内随时间延长而逐渐下降(r=-0.783, P0.05),随后在12-72h内随时间延长而逐渐升高(r=0.679, P0.01)。 Western blot结果显示:在12、24、36和48h时均显著低于相应的对照组水平(P0.05),但在2、6和72h时二者未见明显差异(P0.05)。TAP1蛋白的相对表达量在2-12h内随时间延长而逐渐下降(r=-0.860, P0.01),在12-72h内则逐渐升高但未见存在明显相关关系(r=0.560, P0.05)。结论: 1 FB1能够在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1细胞HLA-I类分子的表达。 2 FB1能够在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1细胞LMP2和TAP1的表达。 3不同剂量、不同作用时间的FB1对GES-1细胞HLA-C mRNA、β2m mRNA和β2m蛋白的表达均无明显影响。 4 FB1可能通过直接抑制HLA-A,B,C蛋白的表达和/或通过间接抑制LMP2和TAP1的表达进而降低细胞表面HLA-I类分子的呈递和表达。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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