肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达纯化及血清学应用

发布时间：2018-07-22 19:55

【摘要】： 目的和意义克隆肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus,Hh)甲基基团接受趋化信号转导蛋白(methyl-accepting chemotaxis signal transduction protein,MCP)基因,制备MCP重组蛋白作为抗原,从而制备ELISA检测试剂盒检测Hh感染者血清中的特异性免疫球蛋白,为检测我国人群肝螺杆菌感染率及探讨人类肝脏疾病和肠道非特异性炎症的病因提供实验基础。材料和方法 1、主要材料:肝螺杆菌菌株,原核表达质粒pET22b(+),抗His单克隆抗体,空肠弯曲菌选择性血琼脂培养基,镍亲和层析柱,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG,辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG。 2、方法 2.1引物设计根据GenBank选取肝螺杆菌基因HH1088中的一段长为255bp的保守区基因片段(即MCP),利用Primer Premier 5.0设计引物,上游(C255F)5'GACGAATTC C GTAGAGCAAGGGGATTTC 3'(含EcoRI酶切位点),下游(C255R)5'CGC CTCGAG TCTTTGTTTGAGCATTTT 3'(含XhoI酶切位点),以肝螺杆菌全基因组为模板,进行PCR扩增。 2.2 MCP基因原核表达质粒的构建肝螺杆菌保种菌液(由本实验室保存)取100μl涂布于空肠弯曲菌选择性血琼脂培养基(含7%冻融脱纤维羊血,选择性抗生素万古霉素10mg/L,多粘菌素B 2500单位/L,二性霉素B 10mg/L,TMP 5mg/L),37℃微需氧条件(5%O_2,10%CO_2及85%N_2)下培养,每天观察有无菌落生长。将透明、针尖大小的菌落用棉签刮至EP管中,PBS冲洗三次后,用细菌基因组DNA提取试剂盒提肝螺杆菌DNA。以肝螺杆菌全基因组DNA为模板,用Hotstart酶进行PCR扩增,反应条件为94℃30min总变性,94℃30s,50℃30s,72℃45s,共35个循环,72℃10min总延伸。所得目的片段回收后在限制性内切酶EcoRI和XhoI作用下37℃水浴1小时进行酶切反应,插入至原核表达载体pET22b(+)的EcoRI和XhoI之间,所得质粒命名为pET22b+/MCP,经酶切及PCR鉴定后进行测序。 2.3 MCP基因在大肠杆菌中的表达将重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感受态BL21(DE3),挑单克隆接种于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基,37℃200rpm培养3个半小时至OD_(600)约为0.6-1.0。转接100μl于10ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中,37℃200rpm培养1个半小时至OD_(600)约为0.6,加入500mmol/L IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃180rpm培养4个小时。将诱导菌液12000rpm 4℃离心5min,取1ml菌液沉淀进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白rhMCP包含表达载体pET22b(+)中的6×His标签,因此用Western blot对rhMCP的表达再次进行鉴定。 2.4 rhMCP蛋白的纯化取1000ml诱导表达的菌液,12000rpm 4℃离心5min,菌体沉淀加入1/20细菌生长体积的细菌裂解液和PMSF,冰上超声破碎细菌,10000rpm 4℃离心15min。弃上清,往沉淀中加入1/20细菌生长体积的UrNTA-0 Buffer和PMSF,将细胞悬浮,室温放置30min,10000rpm 4℃离心15min,取上清。用30ml的UrNTA-0 Buffer平衡3mlNTA层析柱,上清液上柱,收集穿透部分,用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。15ml UrNTA-0 Buffer洗脱未结合部分,然后分别用15mlUrNTA-20,UrNTA-40,UrNTA-60,UrNTA-100,UrNTA-200,UrNTA-500洗脱,收集洗脱液,用SDS-PAGE确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。用梯度PBS-尿素4℃透析(6M-4M-2M-1M),每4小时换液一次,最后用PBS 4℃透析24小时。BCA法测蛋白浓度,-70℃保存。 2.5小鼠H.hepaticus感染血清学分析购买裸鼠21只,其中出生2-3天的乳鼠9只;NIH孕鼠2只,其后解剖NIH悉生鼠24只,NIH普通小鼠6只(均购于南方医科大学动物中心),一方面取结肠组织提取基因组DNA后,以C255F/C255R特异性引物进行PCR扩增,所得PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,阳性者进一步测序鉴定;另一方面经心脏或颈动脉取血,血液置于EP管中室温静置2小时,2000rpm离心15min后取血清,-80℃保存。在棋盘滴定法确定最佳包被浓度和样品最佳稀释度后,以纯化的蛋白rhMCP 5μg/ml包被酶标板,每孔200μl,设复孔,4℃过夜;次日顺序加入1∶100稀释的小鼠血清、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10000稀释)、最后加入底物OPD显色,终止反应后用酶标仪进行双波长测定OD_(492)(OPD敏感波长)和OD_(630)(非敏感波长,可消除孔底指痕、污物的影响)。最终的样品OD值为样品OD值(OD_(492)-OD_(630))与空白孔(只加底物和终止液)的差值。 2.6人类H.hepaticus感染的ELISA血清学检测临界值判定选取2008年12月至2009年3月期间在我院消化科确诊的住院病人,共收集50例患者粪便标本和血清标本作为病例组,其中肝脏疾病10例(包括肝炎后肝硬化8例,肝癌2例),结肠癌10例,肠道溃疡性病变10例(包括克罗恩病4例,溃疡性结肠炎6例),十二指肠溃疡9例,胃部疾病11例(包括单纯性胃炎6例,胃癌5例);从正常人群中选取9例作为正常对照组。粪便标本提取组织DNA后,以C255F/C255R特异性引物进行PCR扩增,所得PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,阳性者进一步测序鉴定;所收集血清标本进行ELISA分析,结合粪便PCR结果确定cutoff值。 2.7利用ELISA血清学检测方法初步探讨人类H.hepaticus感染情况选取2007年11月至2009年3月期间在南方医院消化科确诊的220例住院病人,其中肝脏疾病62例(包括肝炎后肝硬化33例,肝癌29例),结肠癌26例,肠道溃疡性病变36例(包括克罗恩病15例,溃疡性结肠炎21例),肠道感染性及增生性病变33例(包括肠炎8例,肠息肉23例,肠结核2例),十二指肠溃疡16例,胃部疾病41例(包括单纯性胃炎23例,胃癌18例),其它肿瘤5例;从正常人群中选取13例作为正常对照组。收集血清标本进行ELISA分析,以确定的cutoff值判定阳性与阴性结果。 2.8数据的统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行分析,均数用M±SD表示,配对计数资料和多个样本率的比较采用χ~2检验,显著性水准(significant level)α=0.05,P＜0.05认为结果有显著性差异。结果 1、MCP原核表达质粒的构建以肝螺杆菌全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得了约255bp的MCP基因片段,克隆至原核表达载体pET22b(+)后经测序与GenBank数据库公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列完全一致(DNA测序由上海英骏公司完成),成功构建MCP的原核表达质粒pET22b+/MCP。 2、重组融合蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,含重组质粒的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)能够表达相对分子质量M:14118D的重组蛋白rhMCP,SDS-PAGE鉴定后可知rhMCP主要存在于沉淀部分,即rhMCP是以不可溶性的包涵体形式存在。经Western blot鉴定,在约14 KD处可见一特异性条带。 3、重组蛋白的分离纯化由于诱导表达的rhMCP是以不可溶的包涵体形式存在,因此用8M尿素溶解包涵体,再按变性蛋白纯化方法进行梯度尿素洗脱,其中以UrNTA200(咪唑浓度为200mM)洗脱效果最佳,纯化后的rhMCP用透析袋进行梯度尿素-PBS透析复性,复性后得到可溶性rhMCP,用BCA法测蛋白浓度为0.73mg/ml。 4、小鼠H.hepaticus感染血清学分析以小鼠肠粘膜组织提取的基因组DNA作为模板,用肝螺杆菌特异性引物C255F/C255R进行PCR扩增,测得阳性标本22例,阴性标本31例,从阳性标本中随机抽取5例进行DNA测序,测序结果与GenBank公布的MCP基因序列完全一致。以rhMCP作为检测抗原,小鼠血清作为待测样本,进行ELISA血清学检测,以31例阴性标本(以PCR检测确定)的OD值均数+2倍标准误(即M+2SE)作为ELISA cutoff值,则cutoff值为0.390,灵敏度为72.7%,特异度为77.4%。配对计数资料χ~2检验可知ELISA与PCR两种检测方法无显著性差异(P=1.000,P＞0.05(双侧)),且两种诊断方法的吻合度有统计学意义但吻合度一般(κ=0.498,P=0.000) 5、人类H.hepaticus感染的ELISA血清学检测临界值判定肝螺杆菌特异性引物C255F/C255R扩增所收集病例粪便基因组DNA,测得59例标本中阳性者为27例,阴性者为32例,其中正常对照组中阳性者2例,阴性者7例。阳性标本的PCR产物进一步进行DNA测序鉴定,测序结果与GenBank公布的MCP基因序列一致性达99%,仅第42位碱基发生基因缺失(PCR产物测序由上海英骏公司完成)。以rhMCP作为检测抗原,人血清作为待测样本,进行ELISA血清学检测,以正常对照组中7例PCR阴性标本的ELISA OD平均值加2倍标准误(即M+2SE)为cutoff值,则cutoff值为1.081,灵敏度为77.8%,特异度为71.9%。配对计数资料χ~2检验可知ELISA与PCR两种方法在检测Hh感染方面无显著性差异(P=0.607,P＞0.05(双侧)),且两种诊断方法的吻合度有统计学意义但吻合度一般(κ=0.492,P=0.000)。 6、利用ELISA血清学检测方法初步探讨人类H.hepaticus感染情况所收集的233例血清标本以重组蛋白rhMCP作为检测抗原,经ELISA血清学检测估计肝脏疾病组、结肠癌组、肠道溃疡性病变组、肠道感染性及增生性病变组、十二指肠溃疡组、胃部疾病组、其它肿瘤组Hh检测阳性率分别为74.2%、63.0%、66.7%、57.6%、37.5%、39.0%、20.0%。χ~2检验可知各组ELISA Hh检测总体阳性率有显著性差异(χ~2=23.587,P=0.001,P＜0.05)。实验初步发现患肝脏及肠道疾病的病人中Hh阳性率较高,推测在肝螺杆菌可能定植的肝脏及肠道部位所患疾病的患者中Hh ELISA血清学检测阳性率较高。结论本研究通过分子克隆技术,在原核表达系统中成功构建MCP的原核表达质粒pET22b+/MCP,并利用IPTG诱导表达、分离纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。以rhMCP作为检测抗原,以粪便PCR方法做为金标准,通过ELISA血清学方法检测人血清中的特异性免疫球蛋白,初步确定肝螺杆菌ELISA血清学检测方法的临界值,并推测肝螺杆菌可能定植部位所患疾病Hh检测阳性率较高,为进一步调查我国肝螺杆菌人群感染率及探讨人类肝脏疾病和肠道非特异性炎症的病因提供实验基础。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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