骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程的可塑性研究

发布时间：2018-07-26 12:03

【摘要】： 中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后神经功能的恢复非常困难,主要原因是因为脑内神经元的再生能力极差。骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)可在自体获得并能在体外稳定扩增,并可诱导分化成神经细胞,有望用于神经系统疾病的治疗,故骨髓间充质干细胞向神经细胞分化相关的基础医学研究是十分重要的。 大量体外和体内实验研究证明BMSCs可以分化为神经细胞,对于神经系统的损伤具有一定的修复作用。骨髓间充质干细胞分化而来的神经样细胞,虽然表达了神经元及其前体细胞的标记物,但它能否发育为成熟的神经元并表现其功能,仍然存在着很大的分歧,而且BMSCs向神经样细胞分化的分子机理不明,本课题研究将根据这些问题展开工作。 本工作先建立新生大鼠大脑皮层细胞原代培养体系,从该体系中获得培养2 d后的无血清培养基作为条件培养基诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化。诱导培养24 h后,由BMSCs分化而来的神经样细胞具有典型的神经元形态特征,用神经细胞和BMSCs的标记物鉴定此神经样细胞的表型,鉴定的结果是:Nestin(15.07%±1.86%)、β-Ⅲ-Tubulin(46.29%±2.58%)、GFAP(9.54%±1.42%)、NCAM(49.82%±3.46%)、CD106(96.86%±1.82%)、CD90(33.62%±2.48%)、CD44(32.44%±2.45%)、CD29(14.24%±1.84%);不表达NSE、CD45、CD71、CD34。Ⅲ-型β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)被认为是早期神经元标记物,而神经元特异性烯醇化酶(NSE)被广泛认为是成熟神经元标记物之一,结果显示神经样细胞高比例表达β-Ⅲ-Tubulin,不表达NSE,提示由BMSCs分化而来的神经样细胞正处于BMSCs向成熟神经元分化过程的过渡状态。结果还显示神经样细胞还阳性表达CD106、CD90、CD44、CD29,不表达CD45、CD71、CD34,说明由BMSCs分化而来的神经样细胞仍具有BMSCs的表型特征,也提示其处于神经分化的过渡状态。 本工作还使用成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)、丁羟基茴香醚(butyl hydroxy anisol,BHA)联用的传统方法诱导BMSCs向神经样细胞分化。BMSCs先经预诱导液预诱导24 h,再经化学诱导液诱导5h后,呈现出典型的神经元形态特征。用神经细胞和BMSCs的标记物鉴定神经样细胞,结果是:Nestin(21.12%±2.28%)、β-Ⅲ-Tubulin(78.26%±3.52%)、NCAM(79.86%±2.88%)、NSE(70.82%±2.46%)、CD106(96.88%±2.75%)、CD29(64.94%±2.16%);不表达GFAP、CD90、CD44、CD45、CD71、CD34。结果说明由BMSCs分化而来的神经样细胞既具有神经细胞的表型特征也具有BMSCs的部分表型特征,这些结果也提示传统化学诱导方法诱导BMSCs分化而来的神经样细胞正处于BMSCs向成熟神经元分化的过渡状态。 本工作采用以上两种方法诱导BMSCs向神经样细胞分化,再分别用含10%血清的正常培养基继续培养神经样细胞24 h后,发现一个共同的现象:神经样细胞又返回BMSCs的形态。用神经细胞和BMSCs的标记物做免疫荧光鉴定,表型鉴定结果和BMSCs的表型特征类似。接着将鉴定由BMSCs分化而来的神经样细胞返回到具有BMSCs特征的细胞是否具有多向分化潜能,结果显示其仍然具有多向分化潜能,表现为具有成神经、成骨和成脂肪等分化能力。 真正的成熟神经元是神经终端分化细胞,很难逆转为干细胞,说明本研究工作中所得到的神经样细胞有别于真正的神经元,它们可能正处于BMSCs向成熟神经元分化的过渡状态,仍然可以逆转为BMSCs。本工作的结果证实了骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的过程具有可塑性。本研究工作所得到的结果为日后利用骨髓间充质干细胞治疗神经系统疾病提供一定的参考资料,为骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的相关基础研究提供了一定的实验依据。
[Abstract]:The recovery of nerve function after the central nervous system (CNS) injury is very difficult. The main reason is that the regeneration ability of neurons in the brain is very poor. The bone marrow mesenchymal stem cells (bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs) can be obtained in autologous and can be stabilized in vitro, and can be induced to differentiate into nerve cells. For the treatment of nervous system diseases, the basic medical research related to the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells is very important.
A large number of in vitro and in vivo experimental studies have shown that BMSCs can be differentiated into neural cells, which have a certain repair effect on the damage of the nervous system. Neural like cells differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells express the markers of neurons and their precursor cells, but can they develop into mature neurons and demonstrate their function. There are great differences, and the molecular mechanism of BMSCs differentiating into neuron like cells is unknown.
In this work, the primary culture system of neonatal rat cerebral cortex cells was established. The serum-free medium after culture of 2 D was obtained as the conditioned medium to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neurolike cells. After induction and culture of 24 h, the neuron like cells differentiated from BMSCs had typical morphological characteristics of neurons, with the use of God. The phenotype of the nerve like cells was identified by cell and BMSCs markers, and the results were as follows: Nestin (15.07% + 1.86%), beta - -Tubulin (46.29% + 2.58%), GFAP (9.54% + 1.42%), NCAM (49.82% + 3.46%), CD106 (96.86% + 1.82%), CD90 (33.62% + 2.48%), CD44 (32.44% + 46.29%), CD29 (1.42%), and CD71, CD71, type III beta microtubule Protein (beta - III -Tubulin) is considered as an early marker of neuron, and neuron specific enolase (NSE) is widely regarded as one of the markers of mature neurons. The results show that the high proportion of neurolike cells express beta - III -Tubulin and does not express NSE. It suggests that neurolike cells derived from BMSCs are being differentiated from BMSCs into mature neurons. The results also showed that neurolike cells also expressed positive expression of CD106, CD90, CD44, CD29, and did not express CD45, CD71, CD34, indicating that the neuron like cells differentiated from BMSCs still had the phenotypic characteristics of BMSCs, and suggested that they were in the transition state of nerve differentiation.
This work also uses the basic fibroblast growth factor (bFGF), two methyl sulfoxide (dimethyl sulphoxide, DMSO), the traditional method of Ding Qiangji anisole (butyl hydroxy ANISOL, BHA) to induce the differentiation of neural like cells to the nerve like cells. Characteristics of typical neuronal morphology. Neural cells were identified by nerve cells and BMSCs markers. The results were: Nestin (21.12% + 2.28%), beta - -Tubulin (78.26% + 3.52%), NCAM (79.86% + 2.88%), NSE (70.82% + 2.46%), CD106 (96.88% + 2.75%), CD29 (64.94% + 2.16%), and CD90, CD44, CD45, CD71. The neurolike cells have both phenotypic characteristics of the nerve cells and some of the phenotypic characteristics of BMSCs. These results also suggest that the neurolike cells derived from the traditional chemical induction method are in the transition state of the differentiation of the mature neurons from the BMSCs to the mature neurons of the BMSCs.
This work uses these two methods to induce BMSCs to differentiate into neuron like cells, and then continue to cultivate nerve like cells with 24 h with the normal medium containing 10% serum, and find a common phenomenon: nerve like cells return to the morphology of BMSCs. Immunofluorescence identification with nerve cells and BMSCs markers, phenotypic identification results and BMSCs The phenotypic characteristics are similar. Then the identification of neuron like cells differentiated from BMSCs to whether cells with BMSCs characteristics have multiple differentiation potential, the results show that the cells still have multiple differentiation potential, showing the ability to differentiate into neurogenic, osteogenic and adipose tissue.
The real mature neurons are neural terminal differentiated cells, which are difficult to reverse to stem cells. It shows that the neuron like cells in this study are different from the real neurons. They may be in the transition state of BMSCs to mature neurons, and can still be reversed to BMSCs.. The process of cell differentiation to neurolike cells is plastic. The results obtained in this study provide some reference for the future use of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of nervous system diseases, and provide some experimental basis for the basic research on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to neurolike cells.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

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