锌转运体ZnT8在小鼠睾丸和卵巢中表达和分布的研究

发布时间：2018-07-29 18:10

【摘要】： 前言 锌是机体必需的微量元素之一,是体内许多金属结合蛋白和细胞发挥正常功能的必要成分。锌离子不能自由穿越细胞膜,其跨膜转运需要特定的锌离子转运蛋白介导,以维持细胞内锌离子的稳态。锌转运体ZnT8属于SLC30家族,克隆自SLC30A8基因(染色体8q24.11),是一段含有369个氨基酸片段的蛋白。在胰岛素合成过程中,存在于胰岛素分泌小泡上的ZnT8使锌离子进入小泡参与锌胰岛素六聚体的形成,进而参与细胞完成胰岛素形成和储存的过程。因为ZnT8在胰岛alpha细胞、甲状腺腺泡上皮细胞、肾上腺皮质细胞等内分泌细胞也有表达,所以ZnT8被认为是一种与内分泌细胞有紧密联系的锌转运体。本研究中,我们探讨了ZnT8在生殖系统的内分泌细胞内的表达,进一步验证ZnT8与内分泌细胞的关系。 材料与方法 选取健康CD-1成年小鼠30只(雄性和雌性各半,体重20-25克,购自中国医科大学实验动物部),给予充足的食物和自来水。 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平检测ZnT8在睾丸和卵巢的表达,用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR的产物。运用免疫组织化学染色技术检测ZnT8在睾丸的表达。应用金属自显影(AMG)组织化学染色技术显示游离锌离子在睾丸和卵巢两种组织中的分布。应用免疫荧光染色技术验证ZnT8和StAR蛋白在睾丸Leydig细胞和次级卵泡颗粒细胞的共存。 实验结果 1、ZnT8 mRNA在睾丸和卵巢表达的RT-PCR结果 RT-PCR结果显示在250bp和500bp之间(ZnT8引物的大小为323bp)的位置上出现了清楚的条带,表明ZnT8 mRNA在睾丸和卵巢的表达。 2、ZnT8蛋白在睾丸分布与表达的免疫组化结果 与阴性对照组比较,ZnT8蛋白主要分布于睾丸曲精小管之间的Leydig细胞,同时,在曲精小管的基底部的精原细胞也有ZnT8蛋白分布。 3、锌离子在睾丸分布的AMG结果 睾丸的锌离子分布有向曲精小管中心集中的趋势。在曲精小管基底部和曲精小管之间Leydig细胞中,也可以观察到游离锌离子的分布。 4、锌离子在卵巢分布的AMG结果 卵巢的游离锌离子广泛分布于卵巢黄体、初级卵泡和次级卵泡。在次级卵泡,卵母细胞和卵泡膜内侧的颗粒细胞内有大量锌离子分布。 5、睾丸Leydig细胞和卵巢次级卵泡的ZnT8免疫荧光结果 在睾丸的Leydig细胞和卵巢次级卵泡的颗粒细胞层上进行ZnT8和StAR的免疫荧光双标检测,结果显示ZnT8和StAR蛋白共存于这两种类固醇激素分泌细胞。 结论 1、ZnT8 mRNA和蛋白在睾丸和卵巢中均有表达。 2、ZnT8在睾丸中的表达存在特异性,主要集中于Leydig细胞。3、ZnT8在睾丸和卵巢中的表达都与StAR蛋白存在位置上的相关性。
[Abstract]:Zinc is one of the essential trace elements in the body, and it is necessary for many metal binding proteins and cells to function normally. Zinc ions can not cross the cell membrane freely, and their transmembrane transport requires specific zinc ion transporter to maintain the homeostasis of zinc ions in cells. Zinc transporter ZnT8 belongs to SLC30 family. It is cloned from SLC30A8 gene (chromosome 8q24.11) and is a protein containing 369 amino acid fragments. In the process of insulin synthesis, ZnT8, which exists on the insulin-secreting vesicles, makes zinc ions enter the vesicles to participate in the formation of zinc hexamers, and then participate in the process of insulin formation and storage in cells. Because ZnT8 is also expressed in islet alpha cells, thyroid acinar epithelial cells, adrenal cortical cells and other endocrine cells, ZnT8 is considered to be a zinc transporter closely related to endocrine cells. In this study, we investigated the expression of ZnT8 in endocrine cells of reproductive system and further confirmed the relationship between ZnT8 and endocrine cells. Materials and methods 30 healthy CD-1 adult mice (male and female, weighing 20-25 g) were selected and given sufficient food and tap water. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of ZnT8 in testis and ovaries at mRNA level. The products of PCR were separated by 1% agarose gel electrophoresis. Immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of ZnT8 in testis. The distribution of free zinc ions in testis and ovaries was demonstrated by (AMG) histochemical staining. The coexistence of ZnT8 and StAR protein in testicular Leydig cells and secondary follicular granulosa cells was confirmed by immunofluorescence staining. Results 1 RT-PCR results of mRNA expression in testis and ovaries RT-PCR showed that there were clear bands between 250bp and 500bp (the size of ZnT8 primer was 323bp). 2Immunohistochemical results of the distribution and expression of ZnT8 mRNA protein in testis were mainly located in testicular seminiferous cells compared with the negative control group. Leydig cells between tubes, At the same time, ZnT8 protein was also distributed in spermatogonia at the base of seminiferous tubules. 3. Zinc ions distributed in testis by AMG. The results showed that the distribution of zinc ions in testis tended to be concentrated towards the center of seminiferous tubules. In Leydig cells at the base of seminiferous tubules and between seminiferous tubules, The distribution of free zinc ions was also observed. 4. Zinc ions were distributed in the ovarian AMG results the free zinc ions of the ovary were widely distributed in the corpus luteum primary follicles and secondary follicles. In secondary follicles, A large number of zinc ions were distributed in oocytes and granulosa cells inside the follicular membrane. 5. ZnT8 immunofluorescence of testis Leydig cells and ovarian secondary follicles was found in Leydig cells of testis ZnT8 and StAR in granulosa cell layer of ovarian secondary follicles were detected by immunofluorescence double labeling. The results showed that ZnT8 and StAR proteins co-existed in these two steroid hormone secreting cells. Conclusion 1ZnT8 mRNA and protein were expressed in testis and ovary, 2the expression of ZnT8 was specific in testis. The expression of ZnT8 in testis and ovaries was mainly related to the location of StAR protein in Leydig cells.
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【共引文献】

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本文编号：2153570