DC-SIGN分子配体对肺结核患者树突状细胞黏附BCG能力的影响

发布时间：2018-08-06 16:36

【摘要】： 目的 DC-SIGN位于树突状细胞表面,是近年发现的与结核病发生密切相关的一个免疫分子,近年体外细胞水平研究结果显示结核菌可通过其胞壁成分ManLAM与DC-SIGN分子结合,开通下述几种机制抑制宿主抗结核免疫应答:抑制未成熟树突状细胞成熟;诱导周围未被感染的树突状细胞处于半成熟状态;上调树突状细胞表达免疫抑制因子IL-10等。本研究通过探讨DC-SIGN分子配体ManLAM对肺结核患者树突状细胞黏附BCG能力的影响,进一步研究DC-SIGN分子在结核病发生过程中的作用。 方法 1.含有EGFP基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体的构建用KpnⅠ和XbaⅠ对质粒pEGFP和pHSP70-LA73进行双酶切,以制备目的基因和载体大片段,用T4连接酶连接,然后转化已制备好的大肠杆菌感受态细胞DH5α,用含卡那霉素的固体LB培养基筛选重组子。 2.绿色荧光蛋白标记BCG 应用eppendorf电转化仪将重组质粒转化入制备好的BCG感受态细胞,培养至对数生长期后,用热诱导的方法使绿色荧光蛋白表达,从而标记BCG。 3.ManLAM对肺结核患者树突状细胞黏附BCG能力影响的研究分离研究对象外周血单个核细胞,诱导树突状细胞生长,用流式细胞术检测其表面DC-SIGN表达率,并在肺结核患者树突状细胞与不同浓度ManLAM预孵育后,再以5:1的比例加入标记BCG共孵育,流式细胞仪检测树突状细胞表面绿色荧光,测定黏附率。 结果 1.酶切鉴定条带正确,分枝杆菌穿梭质粒构建成功,命名为pHSP70-EGFP。 2.倒置荧光显微镜观察细菌涂片,可见细菌发出较强的绿色荧光,证明绿色荧光蛋白在BCG中表达,标记BCG成功。 3.肺结核患者外周血树突状细胞表面DC-SIGN表达率为(86.69±3.66)%,明显高于健康对照组。肺结核患者外周血树突状细胞和标记BCG的黏附率为(89.84±1.57)%,而伴随着ManLAM浓度的不断增加,树突状细胞和标记BCG的黏附率不断下降。 结论 1.可以用穿梭质粒pHSP70-EGFP在BCG中表达绿色荧光蛋白,从而标记BCG。 2.树突状细胞主要通过与ManLAM配体结合而黏附BCG,同时也证明DC-SIGN是肺结核患者树突状细胞表面结核分枝杆菌的主要受体。
[Abstract]:Objective DC-SIGN, located on the surface of dendritic cells, is an immune molecule closely related to the occurrence of tuberculosis in recent years. In recent years, the results of cell level studies in vitro showed that tuberculous bacillus could bind to DC-SIGN molecule through its cell wall component ManLAM, which could inhibit host anti-TB immune response by inhibiting immature dendritic cell maturation. The peripheral uninfected dendritic cells were induced to be semi-mature, and the expression of immunosuppressive factor IL-10 was up-regulated by dendritic cells. The purpose of this study was to investigate the effect of DC-SIGN ligand ManLAM on the ability of dendritic cells to adhere to BCG in pulmonary tuberculosis patients, and to further study the role of DC-SIGN molecule in the pathogenesis of tuberculosis. Method 1. Construction of Escherichia coli -Mycobacterium Shuttle expression Vector containing EGFP Gene the plasmids pEGFP and pHSP70-LA73 were digested with Kpn 鈪，

本文编号：2168317