早期胚胎细胞中HBs和HBx基因的表达与其启动子甲基化状态的关系

发布时间：2018-08-08 17:21

【摘要】： 【背景与目的】 乙型肝炎是世界各国尤其是我国当前面临的重大公共卫生问题,因此其传播途径,发病机制及诊疗手段的研究一直是各国政府和科学家关注的课题。已有研究证实,乙肝病毒(HBV)基因能够整合到人精子染色体中,由精子带入受精卵的HBV基因能够在早期胚胎细胞中复制与表达,但其分子机制尚不清楚。DNA甲基化是表观遗传学修饰的一个重要内容,在早期胚胎发育中起重要的调节作用。它也是细胞调控宿主基因表达和进入细胞内的病毒基因表达的重要方式。HBV感染可导致宿主细胞表观遗传修饰异常,诱发染色体不稳定,进而影响胚胎的正常发育,整合在宿主基因组中的HBV基因将增加原发性肝癌发生的风险。本课题的目的是通过研究HBV基因在精子、早期胚胎细胞中的甲基化状况,探讨它与HBV基因在早期胚胎细胞中表达的关系。 【材料与方法】 (1)材料:①重组质粒pBR322-HBV;②6-8周龄雌性金黄地鼠;③人精子由HBsAg阴性的志愿者提供;④甲基化试剂盒(Chemicom公司,S7820);(2)方法:①重组质粒转染技术:用pBR322-HBV转染人精子。②用PCR,斑点杂交技术:证实转染的人精子中含有HBV DNA。③人精子、金黄地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精及受精后培养技术:获得早期胚胎细胞。④甲基化PCR(MSP)检测技术:检测HBs和HBx基因启动子在精子和早期胚胎细胞中的甲基化状况。⑤甲基化测序PCR及BLAST分析技术:精确检测HBs基因启动子的甲基化状态。⑥RT-PCR技术:检测胚胎细胞中HBs和HBx基因的表达。 【结果】 ①斑点杂交结果显示,用pBR332-HBV转染的人精子经6次洗涤后,洗液中已不再有HBV DNA,排除了由于洗液污染给实验结果带来的假阳性的可能。②PCR结果表明,精子和早期胚胎细胞基因组中含有HBV DNA序列。③通过人精子、地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精及受精后培养,获得了实验所需的单细胞胚和2-细胞胚样本。④甲基化特异性PCR(MSP)检测结果表明,在重组质粒pBR332-HBV中,HBs和HBx基因启动子区是非甲基化的;而在精子基因组中HBs和HBx基因启动子区已经甲基化了;在单细胞胚和2-细胞胚基因组中,HBs和HBx基因启动子区呈去甲基化状态。⑤甲基化测序PCR(BSP)及BLAST分析表明,在精子基因组样本中可扩增出HBs基因启动子区112 bp的阳性条带,条带区域的所有CpG位点呈甲基化状态。⑥RT-PCR结果表明,由精子带入受精卵的HBs和HBx基因能够在早期胚胎细胞中表达。 【结论】①HBs和HBx基因启动子区在重组质粒中是非甲基化状态。②HBs和HBx基因启动子区在精子基因组中呈甲基化状态。③受精后,HBs和HBx启动子区在单细胞胚和2-细胞胚基因组中呈去甲基化状态。④在单细胞和2-细胞胚中,由精子带入的HBs和HBx基因可在mRNA水平表达。⑤由精子带入的HBs和HBx基因在早期胚胎细胞中表达与其启动子区的去甲基化有关。
[Abstract]:[background and objective] Hepatitis B is a major public health problem facing countries all over the world, especially in China. The study of pathogenesis and diagnosis and treatment has always been concerned by governments and scientists. It has been proved that (HBV) gene of hepatitis B virus can be integrated into human sperm chromosome, and that HBV gene, which is brought into fertilized egg by sperm, can be duplicated and expressed in early embryonic cells. However, its molecular mechanism is not clear. DNA methylation is an important part of epigenetic modification and plays an important role in the regulation of early embryonic development. It is also an important way for cells to regulate the expression of host genes and viral genes entering into cells. HBV infection may lead to abnormal epigenetic modification of host cells, induce chromosomal instability, and then affect the normal development of embryos. Integration of the HBV gene in the host genome increases the risk of primary liver cancer. The aim of this study was to study the methylation of HBV gene in spermatozoa and early embryonic cells. To investigate the relationship between the expression of HBV gene and the expression of HBV gene in early embryonic cells. [materials and methods] (1) the recombinant plasmid pBR322-HBV1 was provided by HBsAg negative volunteers. 4Methylation Kit (Chemicom Company / S7820); (2) methods: 1: 1 Recombinant plasmid transfection technique: pBR322-HBV was used to transfect human spermatozoa with PCR, dot blot hybridization technique: confirmed that the transfected human spermatozoa contained HBV DNA.3 human spermatozoa. In vitro fertilization and post-fertilization culture of golden hamster without pellucida oocytes: acquisition of 4. 4 methylated PCR (MSP) assay of early embryonic cells: detection of methylation of HBs and HBx gene promoters in spermatozoa and early embryonic cells 5 methylation sequencing PCR and BLAST analysis techniques: accurate detection of methylation status of HBs gene promoter. 6 RT-PCR: detection of HBs and HBx gene expression in embryonic cells. [results] 1the results of dot blot hybridization showed that, Human sperm transfected with pBR332-HBV was washed for 6 times and no HBV was found in the washing solution. The genome of spermatozoa and early embryonic cells contains HBV DNA sequence. 3. 3. Through human spermatozoa, hamster zona-free oocyte xenogeneic fertilization and culture after fertilization, The results of 4-methylation specific PCR (MSP) of single cell embryos and 2-cell embryos were obtained. The results showed that the promoter region of HBs and HBx gene was non-methylated in recombinant plasmid pBR332-HBV. However, the promoter region of HBs and HBx gene has been methylated in spermatozoa, and the promoter region of HBS and HBx gene has been demethylated in the genome of single cell embryo and 2-cell embryo. The results of PCR (BSP) and BLAST analysis show that the promoter region of HBS and HBx gene is demethylated. The positive bands of 112bp in the promoter region of HBs gene could be amplified from the samples of sperm genome. All the CpG sites in the region were methylated by .6RT-PCR. HBs and HBx genes brought into fertilized eggs by spermatozoa can be expressed in early embryonic cells. [conclusion] the promoter region of 1HBs and HBx genes is in the non-methylated state of the recombinant plasmid. 2HBs and HBx gene promoters. The region was methylated in the spermatozoa genome. 3. 3 after fertilization, HBs and HBx promoter regions were demethylated in the single cell embryo and 2 cell embryo genome. 4. 4 in the single cell and 2 cell embryos. HBs and HBx genes brought in by spermatozoa can express 5. 5 HBs and HBx genes brought in by spermatozoa at mRNA level are related to demethylation of promoter region in early embryonic cells.
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.62;R346

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本文编号：2172482