P19细胞神经分化模型中NSPc1的靶基因鉴定

发布时间：2018-08-25 09:52

【摘要】：NSPc1是在神经系统高表达的Polycomb家族成员,与干细胞维持因子Bmi1高度同源oNSPc1可以使小鼠胚胎干细胞一定程度上不依赖白血病抑制因子(Leukemic Inhibitory Factor, LIF)进行自我更新；我们的前期研究发现其具有较强的转录抑制作用,并在多种终末分化神经细胞中的表达远远低于神经干细胞,敲低NSPc1可使P19和NT2等神经分化模型细胞增殖能力下降,分化趋势加强。因此人们预测NSPc1也在干细胞维持中起作用,尤其在神经干细胞中功能更重要。但目前尚没有足够的研究阐释NSPc1在神经分化过程中所调控的靶基因信息。 在本实验中,我们首先建立了P19细胞在1μM维甲酸诱导下向神经元分化的模型,这是一个离体研究神经干细胞分化过程的成熟模型。采用Western Blot检测了NSPc1在该模型中表达水平的变化；结果显示NSPc1蛋白的表达水平在P19细胞神经分化模型第6天(相当于神经元)明显低于第0天(相当于未分化干细胞)。 接下来,采用染色质免疫共沉淀结合基因芯片分析(ChIP-on-chip)技术筛查了NSPc1在P19细胞中的靶基因谱,并对其进行了生物信息学分类。筛选出的1280个NSPc1靶基因,在“细胞、代谢、发育”等生物过程中富集,集中于“结合(Binding)、转录调节”两个分子功能群,且多定位于“细胞结构、细胞器”内；并且许多与“分化、发育、转录及其调节、神经发生”相关的基因功能术语(Gene Ontology Terms),在NSPc1靶基因归类中出现的频率显著高于其基因组频率。 最后,综合考虑了芯片结果、既往表达谱芯片结果和基因功能相关文献后,我们选择了靶基因群中的7个预测靶基因进行功能验证,用Real-time PCR检测NSPc1以及这些靶基因在P19细胞神经分化模型中表达水平的变化。这7个靶基因分别为：Cdk9, Hmgb2, Hnrnpl, Rgmb, Rnf10, Tnk2和Zfp148。结果显示,NSPc1的mRNA水平在P19细胞神经分化过程中,第6天时降低,第10天又回升,即在“神经干细胞—神经前体细胞—不成熟神经元”的过程里NSPc1表达下降,但在神经元成熟过程中又再次升高。在7个预测靶基因中：Cdk9和Tnk2在第6天明显降低,Hnrnp1和Rnf10在第6天则明显升高。 可见,在P19细胞神经分化模型中,NSPc1本身的表达是动态变化的；随之也动态地调控着大量参与神经细胞增殖、分化与成熟等过程的靶基因；从NSPc1与选择验证的若干靶基因的相对表达变化看,调控机制很可能是复杂的,多层次的和网络化的。
[Abstract]:NSPc1 is a member of the Polycomb family with high expression in the nervous system. ONSPc1, which is highly homologous to stem cell maintenance factor Bmi1, can make mouse embryonic stem cells independent of leukemia inhibitory factor (LIF) for self-renewal to a certain extent; our previous studies found that NSPc1 has strong transcriptional inhibition, and The expression of NSPc1 in a variety of terminal differentiated neurons is much lower than that in neural stem cells. Knocking down NSPc1 can decrease the proliferation of P19 and NT2 neuronal differentiation model cells and enhance the differentiation trend. Objective to clarify the target gene information regulated by NSPc1 during neural differentiation.
In this experiment, we first established a neuronal differentiation model of P19 cells induced by 1 mu retinoic acid, which is a mature model for studying the differentiation process of neural stem cells in vitro. Model sixth days (equivalent to neurons) were significantly lower than zeroth days (equivalent to undifferentiated stem cells).
Next, the target gene profiles of NSPc1 in P19 cells were screened by chromatin immunoprecipitation combined with gene chip analysis (ChIP-on-chip) and bioinformatics classifications were carried out. "Two functional groups of molecules, most of which are located in"cell structure, organelles"; and many Gene Ontology Terms related to"differentiation, development, transcription and regulation, neurogenesis"appear more frequently in the classification of NSPc1 target genes than in their genomic frequencies.
Finally, considering the results of the microarray, the results of the previous microarray and the literature related to gene function, we selected seven predictive target genes from the target gene group for functional verification. Real-time PCR was used to detect the expression level of NSPc1 and these target genes in P19 cell neural differentiation model. Hmgb2, Hnrnpl, Rgmb, Rnf10, Tnk2 and Zfp148. The results showed that the mRNA level of NSPc1 decreased on day 6 and increased again on day 10 during the neural differentiation of P19 cells, that is, the expression of NSPc1 decreased during the process of "neural stem cells-neural precursor cells-immature neurons", but increased again during the maturation of neurons. Target genes: Cdk9 and Tnk2 decreased significantly on the sixth day, while Hnrnp1 and Rnf10 increased significantly in sixth days.
It can be seen that the expression of NSPc1 itself is dynamic in the neural differentiation model of P19 cells; it also dynamically regulates a large number of target genes involved in the process of neural cell proliferation, differentiation and maturation; from the relative expression changes of NSPc1 and several target genes verified by selection, the regulatory mechanism is likely to be complex, multi-level and network. Collaterals.
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329.2

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本文编号：2202521