结核分枝杆菌GlmU的表达、纯化及其酶促反应动力学研究

发布时间：2018-09-03 15:44

【摘要】： 从世界范围来看,结核病仍是一种发病率和死亡率极高的传染性疾病,全球人口的三分之一感染了结核分枝杆菌,而且,其发病率也呈逐年上升的趋势。如今,耐多药结核病(MDR-TB)不断增多,使原本可以治愈的结核病再次成为治疗难点。因此,当前的首要任务是从结核分枝杆菌自身寻找新的靶点,以此来研发新的抗结核药物。 靶点的选择当然离不开结核分枝杆菌坚厚的细胞壁结构,它是结核分枝杆菌赖以生存的重要部件,细胞壁独特的结构成为近年来研究的焦点,其核心层由三部分组成:靠近细胞膜的肽聚糖、中间的聚阿拉伯半乳糖及最外的分枝菌酸,聚阿拉伯半乳糖通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子与肽聚糖相连。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供体,其合成须经历四步反应,GlmU以其双功能参与其中乙酰化和尿苷化反应;同时基因敲除模型已证实glmU为细菌生长的必需基因。另外,UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成在人体中有所不同,葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶活性在人体中不存在。因此,GlmU,尤其是其乙酰转移酶活性是一个潜在的药物作用靶点,研究其乙酰转移酶特性有助于研发安全可靠且无毒性的抗结核药物。 本论文目的是:(1)用pET16b表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达结核分枝杆菌GlmU蛋白; (2)采用亲和层析技术纯化GlmU蛋白,并用SDS-PAGE以及Western blotting鉴定所纯化的GlmU蛋白;(3)对GlmU酶活性测定方法进行比较,从中选择可用于高通量筛选GlmU抑制剂的检测方法;(4)对GlmU进行酶促反应动力学研究,确定最佳反应条件并测定其反应动力学常数Km值以及Vmax,便于日后筛选抑制剂。 本论文所获的结果如下: 1.诱导GlmU蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达 用1mM IPTG,30oC振荡培养3.5小时,诱导BL21(DE3)表达重组GlmU蛋白。用超声法破碎细菌,对上清组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,在上清中存在高表达的GlmU蛋白,分子量为54.10 kD。 2.采用亲和层析技术纯化GlmU蛋白 pET16b表达载体使重组GlmU蛋白N端带有组氨酸标签,因此,用组氨酸-Ni2+亲和层析技术对GlmU蛋白进行纯化。用SDS-PAGE分析洗脱组分1-5,结果表明,洗脱组分2-5蛋白纯度很高,无其他杂蛋白存在。用Western blotting分析洗脱组分3-5,结果表明,纯化所得的蛋白为GlmU蛋白。用考马斯亮蓝法定量洗脱组分4的浓度为442μg/ml,该组分用于酶活性分析。 3.建立测定GlmU酶活性的测定方法,便于建立高通量筛选酶抑制剂的方法 GlmU乙酰转移酶活性: (1) HPLC法:采用Nova-Pak C18 (3.9×150 mm,4μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲液(pH6.5)-甲醇(95:5)为流动相,流速1.0 mLmin-1,在波长259 nm处检测产物HSCoA,其洗脱时间在9.6 min左右。 (2)化学显色法:酶反应体系中加入DTNB (Ellman’s Reagent),通过检测巯基进而测定产物HSCoA含量,用酶标仪在405 nm处测吸光值的改变。 GlmU尿苷转移酶活性: (1) HPLC法:采用Nova-Pak C18 (3.9×150mm,4μm)色谱柱,以20 mM三乙胺-醋酸缓冲液(pH 4.0)为流动相,流速0.5mLmin-1,在波长260nm处检测反应产物UDP-GlcNAc,其洗脱时间为7.8 min。 (2)化学显色法:偶联焦磷酸酶将反应产物焦磷酸水解为磷酸,磷酸与钼酸铵形成磷钼酸复合物后使孔雀石绿颜色由黄绿变为蓝绿,用酶标仪在630 nm处检测吸光值变化,以测定所生成磷酸的含量。 4.研究GlmU蛋白酶促反应动力学特性 (1)初速度的确定: GlmU乙酰转移酶活性:将反应底物GlcN-1-P和AcCoA与不同浓度GlmU蛋白在37oC反应不同时间,绘制酶浓度曲线和反应时间进程曲线。结果表明GlmU乙酰转移酶反应初速度酶浓度范围为0.88μg/ml,时间范围为5 min。 尿苷转移酶活性:反应底物GlcNAc-1-P、UTP和焦磷酸酶与不同浓度GlmU在37oC反应不同时间,绘制酶浓度曲线和反应进程曲线。结果表明GlmU尿苷转移酶反应初速度酶浓度范围为1.33μg/ml,时间范围为5 min。 (2)确定GlmU两种活性的最佳反应条件: 分别改变反应体系的温度和pH值,测其产物生成量。GlmU乙酰转移酶的最适温度为30oC,最适pH值为8.0,且其活性不需要Mg2+的参与;GlmU尿苷转移酶最适温度为42oC,最适pH值为8.0,在没有Mg2+存在时,检测不到尿苷转移酶的活性,可见Mg2+是GlmU尿苷转移酶的激活剂,其最适浓度为20 mM。 (3)在最佳反应条件下测得GlmU酶动力学常数: 在初速度范围内,采用最佳反应条件,保证一种底物过量,改变另一种底物浓度采用双倒数法测其Km值和Vmax。对乙酰转移酶来说,AcCoA的Km值为0.224±0.07mM,最大速率Vmax为0.119±0.038 mMmin-1,GlcN-1-P的Km值为0.061±0.005mM,最大速率Vmax为0.081±0.003mMmin-1;对尿苷转移酶来说,底物GlcNAc-1-P的Km值为0.044±0.005mM,最大速率Vmax为0.0054±0.0002mMmin-1,底物UTP的Km值为0.024±0.0015mM,最大速率为0.006±0.0001mMmin-1。 结论: GlmU在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达为我们研究其酶促反应动力学特性提供了物质保障;针对GlmU两种酶活性所建立的化学显色方法精确、简便,便于酶促反应动力学特性的研究及高通量筛选GlmU抑制剂;研究了GlmU酶促反应动力学特性,确定了最佳反应条件及其反应动力学常数Km和Vmax。
[Abstract]:Tuberculosis is still an infectious disease with high morbidity and mortality worldwide. One third of the world's population is infected with Mycobacterium tuberculosis, and its incidence is on the rise year by year. Today, the increasing number of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) makes it difficult to treat tuberculosis that could be cured once again. Therefore, the primary task now is to find new targets from Mycobacterium tuberculosis itself to develop new anti-tuberculosis drugs.
Target selection is of course inseparable from the strong cell wall structure of Mycobacterium tuberculosis, which is an important part of the survival of Mycobacterium tuberculosis. The unique structure of cell wall has become the focus of recent research. The core layer consists of three parts: peptidoglycan near the cell membrane, polyarabinogalactose in the middle and mycobacterial acid in the outermost. Arabinogalactose is linked to peptidoglycan via L-rhamnose-D-N-acetylglucosamine disaccharide conjugation molecule. UDP-N-acetylglucosamine is a glycosyl donor of N-acetylglucosamine, and its synthesis undergoes four steps. GlmU participates in acetylation and ureaylation with its bifunctional function. At the same time, gene knockout model has confirmed that glmU is necessary for bacterial growth. In addition, the biosynthesis of UDP-N-acetylglucosamine is different in humans, and the activity of glucosamine-1-phosphate acetyltransferase does not exist in humans. Therefore, GlmU, especially its acetyltransferase activity, is a potential drug target. Studying the characteristics of UDP-N-acetylglucosamine acetyltransferase is helpful to develop safe, reliable and non-toxic anti-knotting drugs. Nuclear drugs.
The purpose of this paper is: (1) to express the GlmU protein of Mycobacterium tuberculosis in E. coli BL21 (DE3) by pET16b expression vector; (2) to purify the GlmU protein by affinity chromatography, and to identify the purified GlmU protein by SDS-PAGE and Western blotting; (3) to compare the methods for determining the activity of GlmU enzyme, and select the high-throughput screening method. GlmU inhibitor detection method was selected; (4) GlmU enzymatic reaction kinetics was studied to determine the optimal reaction conditions and determine the reaction kinetics constant Km value and Vmax, so as to facilitate the screening of inhibitors in the future.
The results obtained in this paper are as follows:
1. induce the high expression of GlmU protein in Escherichia coli BL21 (DE3).
BL21 (DE3) was induced to express recombinant GlmU protein by 1 mM IPTG and 30 oC shaking culture for 3.5 hours. The supernatant was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that there was a high expression of GlmU protein in the supernatant with a molecular weight of 54.10 kD.
2. purification of GlmU protein by affinity chromatography
The recombinant GlmU protein was purified by histidine-Ni2+ affinity chromatography. The elution fraction 1-5 was analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the purity of the elution fraction 2-5 was high and no other impurity proteins were found. The elution fraction 3-5 was analyzed by Western blotting. GlmU protein was obtained. The concentration of elution component 4 was 442 ug/ml by Coomassie brilliant blue method. The component was used for enzyme activity analysis.
3. establish a method for the determination of GlmU enzyme activity and facilitate the establishment of a high throughput screening method for enzyme inhibitors.
GlmU acetyltransferase activity:
(1) HPLC method: Nova-Pak C18 (3.9 x 150 mm, 4 micron) column was used. Phosphate buffer (pH 6.5) -methanol (95:5) was used as mobile phase. The flow rate was 1.0 mLmin-1. The elution time of HSCoA was about 9.6 min at 259 nm.
(2) Chemical colorimetry: DTNB (Ellman's Reagent) was added into the enzyme reaction system, and the content of HSCoA was determined by detecting the thiol group. The absorbance was measured at 405 nm by enzyme labeling instrument.
GlmU uridine transferase activity:
(1) HPLC method: The reaction product UDP-GlcNAc was detected by Nova-Pak C18 (3.9 *150 mm, 4 micron) column with 20 mM triethylamine-acetic acid buffer (pH 4.0) as mobile phase at a flow rate of 0.5 mL min-1 at a wavelength of 260 nm. The elution time was 7.8 min.
(2) Chemical colorimetry: pyrophosphatase was used to hydrolyze pyrophosphate into phosphoric acid, phosphoric acid and ammonium molybdate formed phosphomolybdic acid complex, then the color of malachite green changed from yellow green to blue green. The absorbance value of malachite green was measured at 630 nm to determine the content of phosphoric acid.
4. the kinetics of GlmU protease reaction was studied.
(1) determination of initial velocity:
GlmU acetyltransferase activity: GlcN-1-P and AccCoA were reacted with different concentrations of GlmU protein in 37oC for different time, and the enzyme concentration curve and reaction time curve were drawn.
Urotransferase activity: substrate GlcNAc-1-P, UTP and pyrophosphatase reacted with different concentrations of GlmU at 37oC for different time, and plotted the enzyme concentration curve and reaction process curve. The results showed that the initial reaction rate of GlmU urease enzyme concentration range was 1.33 ug/ml, the time range was 5 minutes.
(2) determine the best reaction conditions for GlmU two activities:
The optimum temperature of GlmU acetyltransferase is 30oC, the optimum pH is 8.0, and the activity of GlmU acetyltransferase does not need the participation of Mg2 +; the optimum temperature of GlmU urease transferase is 42oC, and the optimum pH is 8.0. In the absence of Mg2 +, the activity of urease transferase can not be detected. It can be seen that Mg2 + is GlmU uridine. The optimum concentration of activator of transferase is 20 mM.
(3) GlmU enzyme kinetic constants were measured under the best reaction conditions.
The Km value and Vmax of AcCoA were measured by double reciprocal method. For acetyltransferase, the Km value of AcCoA was 0.224+0.07mM, the maximum rate of Vmax was 0.119+0.038 mMmin-1, the Km value of GlcN-1-P was 0.061+0.005mM, and the maximum rate of Vmax was 0.081+0.003mM. For urease, the Km value of substrate GlcNAc-1-P was 0.044+0.005mM, the maximum rate Vmax was 0.0054+0.0002mmin-1, the substrate UTP Km value was 0.024+0.0015mM, and the maximum rate was 0.006+0.0001mmmmin-1.
Conclusion:
The soluble expression of GlmU in E. coli BL21 (DE3) provides a material guarantee for us to study the kinetic characteristics of enzymatic reaction; the chemical coloration method for GlmU enzymatic reaction is accurate, simple, convenient for the study of kinetic characteristics of enzymatic reaction and high throughput screening of GlmU inhibitors; the kinetic characteristics of enzymatic reaction of GlmU are studied. The optimum reaction conditions and the kinetic constants Km and Vmax. were determined.
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378;Q78

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