蛋白激酶C-α对内髓集合管上皮细胞系mIMCD3骨架actin的影响

发布时间：2018-09-06 18:26

【摘要】：目的 研究蛋白激酶C-α(PKC-α)对内髓集合管上皮细胞系(mIMCD3)骨架actin的影响,初步探讨PKC-α在集合管对尿液物质转运的作用机制及意义。 方法 常规体外培养mIMCD3细胞,提取四种不同的PKC-α基因的重组体,脂质体介导其转染入mIMCD3细胞,用PKC-α基因的表达载体抗性基因药物G418筛选后获得稳定转染细胞,随机分为①空质粒转染组(K组):转染PKC-α基因空质粒重组体的细胞②野生型转染组(W组):转染PKC-α基因野生型质粒重组体的细胞③显性激活型质粒转染组(A组):转染PKC-α基因显性激活型质粒重组体的细胞④显性灭活型质粒转染组(R组):转染PKC-α基因显性灭活型质粒重组体的细胞。转染后24h显微镜下观察转染细胞的荧光表达情况,评估转染效率;转染后72h细胞用含有G418药物的培养基培养,并最终获得稳定表达PKC-α基因的细胞。Real-time实时荧光定量PCR检测上述各组稳转细胞的PKC-αmRNA表达水平变化,western blot检测各组稳转细胞中PKC-α蛋白表达及其活性,细胞免疫化学方法检测各组稳转细胞骨架actin的结构变化。 结果 ⑴成功获取了稳定表达不同PKC-α基因重组体的mIMCD3细胞系。⑵荧光显微镜下观察转染后24h细胞荧光表达情况,转染效率平均为36±2%。⑶Real-time荧光定量PCR结果显示:A组、W及R组PKC-αmRNA表达较K组明显升高(p0.05),而A组、W及R组三组间比较,变化不明显(p0.05)。western blot结果显示:A组、R组及W组PKC-α蛋白表达较K组明显升高(p0.05),而W组、A组与R组三组间比较,没有明显差别(p0.05);PKC-活性检测显示A组与其它三组比较活性明显升高(p0.05),R组活性较其它组明显下降(p0.05)。⑷细胞免疫化学显示:K组及W组主要分布在细胞顶膜周边,两组间没有较大区别,而A组同其它组相比, actin向细胞顶膜聚集增多,细胞内相对较少;R组同其它组相比,actin主要集中于细胞内,且分布紊乱,细胞顶膜看不到正常的骨架结构环。 结论 PKC-α影响mIMCD3骨架actin的解聚和重新分布, actin的这种变化有可能影响集合管上皮细胞的物质转运。
[Abstract]:Objective to study the effect of protein kinase C- 伪 (PKC- 伪) on skeleton actin of inner medullary collecting duct epithelial cell (mIMCD3), and to explore the mechanism and significance of PKC- 伪 in urine transport. Methods mIMCD3 cells were cultured in vitro, four kinds of recombinant PKC- 伪 gene were extracted and transfected into mIMCD3 cells mediated by liposome. Stable transfection cells were obtained by G418 screening. Randomly divided into 1 empty plasmid transfection group (K group): cell 2 wild-type transfection group (W group) transfected with empty plasmid recombinant of PKC- 伪 gene; cell 3 dominant activated plasmid transfection group (A group) transfected PKC- 伪 gene wild-type plasmid recombinant: transfection group (A group). Cell 4 dominant inactivated plasmid transfection group (R group) of PKC- 伪 gene dominant activated plasmid: cells transfected with PKC- 伪 dominant inactivated plasmid recombinant. The fluorescent expression of transfected cells was observed under microscope 24 hours after transfection and the transfection efficiency was evaluated. Finally, the stable expression of PKC- 伪 gene in the cells. Real-time real-time quantitative PCR was obtained to detect the expression of PKC- 伪 mRNA in the above groups. Western blot was used to detect the expression and activity of PKC- 伪 protein in the cells. The structural changes of actin in stable cytoskeleton were detected by immunocytochemistry. Results (1) the fluorescent expression of different PKC- 伪 gene expression in mIMCD3 cell line was observed under fluorescence microscope 24 hours after transfection. The average transfection efficiency was 36 卤2%.3Real-time. The results of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of PKC- 伪 mRNA in group W and R was significantly higher than that in group K (p0. 05), while the expression of PKC- 伪 mRNA in group A and group R was significantly higher than that in group K (p0. 05). The results of western blot showed that the expression of PKC- 伪 protein in W and R groups was significantly higher than that in K group (p0.05), but the expression of PKC- 伪 protein in W group was significantly higher than that in R group (p0.05), while the expression of PKC- 伪 protein in W group was significantly higher than that in Group K group (p0.05). No significant difference (p0.05) in PKC- activity showed that the activity of group A was significantly higher than that of the other three groups (p0.05). The activity of group A was significantly lower than that of other groups (p0.05). 4. The cytoimmunochemistry showed that group K and group W were mainly distributed around the apical membrane, and there was no significant difference between the two groups. Compared with other groups, the concentration of actin to the apical membrane in group A was higher than that in other groups. In group R, the concentration of actin in cells was mainly concentrated in the cells, and the distribution of actin was disordered. There was no normal cytoskeletal structure ring in the apical membrane of group A. Conclusion PKC- 伪 affects the depolymerization and redistribution of actin in mIMCD3 skeleton, and this change of actin may affect the material transport of collecting duct epithelial cells.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

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本文编号：2227160