骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞RhoA、p27的表达

发布时间：2018-09-11 16:20

【摘要】： 目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对肝星状细胞(HSCs)RhoA信号因子及其细胞周期调控因子p27表达的影响,探讨MSCs调控HSCs细胞周期G1/S转换机制。 方法贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠MSCs,传代至第4代使用;大鼠肝星状细胞(HSC-T6)系及纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔塑料细胞培养盒,每孔使用半透膜(transwell insert)建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。实验分3组:空白对照组;阴性对照组;MSCs实验组.用WST-8法对肝星状细胞增殖率进行测定;流式细胞仪检测细胞周期;RT-PCR、Western blot检测MSCs与HSCs共培养后HSCs内RhoA,p27 mRNA和蛋白的表达。 结果(1) HSCs与MSCs共培养24h后,HSCs表现明显增殖抑制(P0.01),且呈现时间依赖性.MSCs试验组与空白对照组、阴性对照组比较均有显著性差异(P0.01;P0.01)。(2)共培养12h后,MSCs可阻滞HSCs由G0/G1期向S期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,与空白对照组、阴性对照组比较差异均有统计学意义(P0.01)。(3)共培养12h后,MSCs实验组RhoA mRNA表达与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(P0.05;P0.01),随时间的延长呈递减趋势;共培养后,MSCs实验组p27 mRNA表达与空白对照组、阴性对照组比较均无统计学差异。(4)共培养12h后,MSCs实验组RhoA蛋白表达与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(P0.01,P0.01),随时间的延长呈递减趋势;共培养12h后, MSCs实验组p27蛋白与空白对照组、阴性对照组比较均有统计学差异(P0.01;P0.01),随时间的延长呈递增趋势。(5)相关性分析显示: RhoA与p27 mRNA的表达无明显相关( r=-0.105);RhoA与p27蛋白的表达呈显著负相关( r=-0.943, P0.01)。 结论骨髓间充质干细胞抑制肝星状细胞增殖的机制可能是通过RhoA-p27通路调控HSCs细胞周期改变;RhoA活性的下调可能是引起HSCs内p27蛋白表达增加的原因。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of rat bone marrow mesenchymal stem cell (MSCs) on the expression of (HSCs) RhoA signal factor and cell cycle regulator p27 in hepatic stellate cells in vitro and to explore the mechanism of MSCs regulating the G 1 / S transition of HSCs cell cycle. Methods SD rat MSCs, was cultured by adherent screening and purified to the 4th passage, and rat hepatic stellate cell (HSC-T6) and fibroblast cell lines were used after freeze-thawing. A 6 well plastic cell culture box was used to establish the upper and lower double layer cell coculture system by using semi-permeable membrane (transwell insert) in each hole, and conventional culture was carried out. The experiment was divided into 3 groups: blank control group, negative control group and MSCs experimental group. The proliferation rate of hepatic stellate cells was determined by WST-8 assay, and the expression of RhoA,p27 mRNA and protein in HSCs after co-culture of MSCs and HSCs was detected by flow cytometry. Results (1) HSCs and MSCs co-cultured for 24 hours showed obvious inhibition of proliferation (P0.01), and showed time-dependent. MSCs in the experimental group and the blank control group, there were significant differences (P0.01-P0.01). (2) after co-cultured for 12 h, the HSCs could block the transition from G0/G1 phase to S phase. Compared with the control group and the negative control group, there were significant differences in the expression of RhoA mRNA between the experimental group and the blank control group after 12 hours of co-culture (P0.01). (3). The expression of p27 mRNA in the control group was significantly higher than that in the control group (P0.05, P0.01), and the expression of p27 mRNA in the co-cultured group was significantly higher than that in the control group. There was no significant difference between the negative control group and the negative control group. (4) after co-culture for 12 hours, the expression of RhoA protein in the experimental group was significantly different from that in the blank control group (P 0.01). After co-culture for 12 hours, the p27 protein in MSCs group was compared with that in control group. There were significant differences between the negative control groups (P0.01, P0.01), and increased with time. (5) correlation analysis showed that there was no significant correlation between the expression of RhoA and p27 mRNA (r-0.105) and the expression of p27 protein was negatively correlated (r-0.943, P0.01). Conclusion the mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells inhibiting the proliferation of hepatic stellate cells may be due to the down-regulation of HSCs cell cycle change by RhoA-p27 pathway, which may lead to the increase of p27 protein expression in HSCs.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

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本文编号：2237196