高表达蛋白Mst1对人胚肾HEK293细胞凋亡和增殖的影响

发布时间：2018-09-14 12:32

【摘要】： 目的建立受四环素诱导表达外源基因Mst1的真核表达体系人胚肾293(HEK293)细胞株,用于进一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系统建立四环素可调控的表达体系。首先,构建含有目的基因Mst1的质粒pcDNA4/TO-Mst1。其次,将调节性pcDNA6/TR质粒用脂质体介导法转染人胚肾293细胞,经药物Blasticidin S筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆扩增后再瞬时转染质粒pcDNA4/TO-Mst1并用Zeocin筛选并挑选单克隆。然后经四环素诱导表达,通过Western Blot方法检测目的基因Mst1的表达水平,从而筛选出由四环素诱导的高表达外源基因Mst1的人胚肾293单克隆细胞株。结果通过T-REx系统成功构建由四环素调控的高表达外源基因Mst1的人胚肾293细胞株。结论四环素诱导表达目的基因Mst1的人胚肾293细胞株可用于外源基因的真核调控表达,为研究目的基因Mst1及其它真核基因功能提供了一种有力的实验手段。 目的探讨四环素诱导性表达外源性Mst1(Mammalian sterile 20-like kinase 1)对HEK 293细胞增殖与凋亡的影响。方法在已经成功构建的四环素可诱导表达Mst1的HEK 293细胞系中,加入四环素诱导Mst1在HEK293细胞中高表达。通过蛋白Western Blot分析Mst1在HEK 293细胞中的表达情况;分别在加入四环素后12, 24,36,48小时通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)观察高表达Mst1后对细胞增殖的影响;加入四环素后36小时加入BrdU,通过其掺入比率来显示Mst1对细胞增殖的影响;加入四环素后后36小时,加入顺铂作用14小时后通过Annexin V检测其对细胞凋亡的影响。结果四环素成功诱导Mst1高表达;MTT及BrdU结果显示在HEK 293细胞中高表达Mst1后细胞增殖明显受到抑制;Annexin V检测结果提示高表达Mst1后,细胞的凋亡率相对增高。结论在HEK 293细胞中高表达Mst1,不仅可以抑制细胞增殖,还可促进细胞凋亡。
[Abstract]:Objective to establish an eukaryotic expression system of human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line which was induced by tetracycline to express exogenous gene Mst1 for further study of gene function. Methods T-REx (Tetracycline-Regulated Expression) system) was used to establish a tetracycline regulatory expression system. Firstly, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1. containing the target gene Mst1 was constructed. Secondly, the regulatory pcDNA6/TR plasmid was transfected into human embryonic kidney 293 cells by liposome-mediated method, and the clone screened by drug Blasticidin S was monoclonal by limited dilution method. After amplification, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1 was transiently transfected and Zeocin was used to screen and select the monoclonal. After tetracycline induced expression, the expression level of target gene Mst1 was detected by Western Blot method, and then the human embryonic kidney 293 cell line with high expression of exogenous gene Mst1 induced by tetracycline was selected. Results the human embryonic kidney 293 cell line was successfully constructed by tetracycline regulated by T-REx system with high expression of exogenous gene Mst1. Conclusion Tetracycline induced human embryonic kidney 293 cell line expressing the target gene Mst1 can be used to regulate the eukaryotic expression of exogenous gene, which provides a powerful experimental means for studying the function of the target gene Mst1 and other eukaryotic genes. Objective to investigate the effects of tetracycline induced expression of exogenous Mst1 (Mammalian sterile 20-like kinase 1 on proliferation and apoptosis of HEK 293 cells. Methods Tetracycline induced high expression of Mst1 in HEK293 cells was found in HEK 293 cell line which was successfully constructed by tetracycline induced expression of Mst1. The expression of Mst1 in HEK 293 cells was analyzed by protein Western Blot, and the effect of high expression of Mst1 on the proliferation of HEK 293 cells was observed by (MTT) assay. The effect of Mst1 on cell proliferation was demonstrated 36 hours after adding tetracycline and Annexin V by Annexin V at 36 hours after adding tetracycline and 14 hours after adding tetracycline. Results Tetracycline successfully induced the high expression of Mst1 and BrdU results showed that the proliferation of HEK 293 cells was significantly inhibited after high expression of Mst1. The results of Annexin V assay showed that the apoptosis rate of HEK 293 cells increased after the high expression of Mst1. Conclusion overexpression of Mst1, in HEK 293 cells can not only inhibit cell proliferation, but also promote apoptosis.
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R692;R346

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本文编号：2242722