化学修饰的iGb3类似物优势诱导NK细胞分泌Th1类细胞因子的分子机制研究

发布时间：2018-09-15 19:43

【摘要】： 目的自然杀伤T(natural killer T cells,NKT)细胞是一类能够识别非经典的MHCⅠ类分子CD1d所递呈的糖脂抗原的特殊类型的T淋巴细胞,同时表达NK和T细胞表面标志NK1.1和TCR。NKT细胞经内源性配体鞘糖脂iGb3(isoglobotrihexosylceramide )和外源性糖脂配体α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)活化后能够分泌IFN-γ、IL-4和IL-13等多种细胞因子,在抗肿瘤、抗病毒感染、自身免疫耐受和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。但由于激活后的NKT细胞能够同时分泌Th1和Th2两型细胞因子,影响了iGb3或α-GalCer对免疫相关疾病的治疗效果,因而限制了其临床应用。因此,若能发现有效的途径,积极调控两型细胞因子的相对产生量,糖脂分子将会在临床应用中发挥更广泛的作用。 研究发现对α-GalCer的鞘鞍醇链进行截短所得的类似物OCH,可通过降低糖脂分子-CD1d复合物的稳定性和增强糖脂分子-TCR的亲和力来实现IL-4的优势分泌。而另有研究表明将连接糖基部分与另外两条链的O原子用C原子代替后产生的α-GalCer类似物α-C-GalCer,可以通过增强糖脂分子各部分之间连接的稳定性而延长了与CD1d和NKT细胞作用的时间来实现IFN-γ的优势分泌。提示,针对性改造糖脂,可以诱导NKT细胞Th1/ Th2型细胞因子的分泌。虽然有众多学者设计不同的位点对糖脂行各种修饰改造,并分析改造后的糖脂活化NKT细胞方面功能和结构的差异,但目前缺乏对于内源性配体iGb3进行改造的研究。 鉴于此,我们对iGb3和α-GalCe进行修饰,获得了一批化学修饰的iGb3和α-GalCe类似物,在前期工作中,我们初步筛选出两种类似物4-HO-iGb3和4'''-dh-iGb3具有优势诱导小鼠肝脏NKT细胞Th1型细胞因子的分泌能力。本研究采用四聚体染色法进一步筛选并确定经过化学修饰的iGb3类似物细胞因子的优势分泌,并在此基础上,深入探讨糖脂/APC/TCR间的相互作用以及细胞微环境等一些影响NKT细胞因子分泌的重要因素,为糖脂类分子的设计和临床应用提供新的策略和依据。 方法(1)流式细胞术法检测iGb3类似物和α-GalCer类似物对小鼠肝脏、脾脏中NKT细胞的数量和胞内细胞因子IFN-γ和IL-4的表达情况,以及转录因子STAT1和STAT6的STAT1磷酸化水平。(2)体外诱导小鼠骨髓来源树突装细胞的分化和成熟。(3) ELISA法检测化学修饰的iGb3类似物作用后小鼠血清中和细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平。(4)实时定量PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞中IFN-γ、IL-4、GATA-3和T-bet的基因表达情况。(5) QSAR软件分析糖脂分子与NKT细胞上TCR受体以及APC细胞上CD1d分子的亲和力高低。(6)蛋白质免疫印迹检测iGb3类似物对小鼠脾脏淋巴细胞转录因子T-bet和GATA-3的蛋白表达情况。 结果 一、化学修饰的iGb3类似物4’’’-dh-iGb3优势诱导小鼠肝脏和脾脏NKT细胞分泌IFN-γ 予C57BL/6小鼠腹腔注射iGb3及其类似物,发现与iGb3刺激组相比,化学修饰的iGb3类似物4’’’-dh-iGb3虽然并不增加肝脾NKT细胞的比例和数量,但可明显增强肝脾NKT细胞胞内IFN-γ的表达、分泌及血清中IFN-γ水平,而对Th2类细胞因子IL-4的表达和分泌无明显影响。用骨髓来源的DC负载糖脂,体外刺激小鼠的NKT细胞系,检测NKT细胞胞内细胞因子表达和上清细胞因子含量,亦得到了类似的结果。 二、4′′′-dh-iGb3可增强糖脂与CD1d、糖脂与NKT细胞TCR之间的结合力和稳定性 运用QSAR软件,在计算机上模拟糖脂、抗原递呈细胞的CD1d分子以及NKT细胞的TCR分子的空间结构,并进行分子结构之间的对接,发现在iGb3鞘鞍醇链引入HO可以形成一个疏水键,与原来酰基链上现有的HO一同直接地深入到CD1d分子形成的疏水性抗原结合口袋中,而增强了与CD1d分子上氨基酸Asp80(C)之间的亲和力;对糖基进行脱氧处理,使糖脂在与TCR分子氨基酸Lys167结合的空间位置由糖脂的此侧转变为糖脂的彼侧,使糖脂与TCR之间的结合分数由原来的3.3显著提高到4.9,增加了4'''-dh-iGb3与NKT细胞TCR的结合能力。即:修饰后的4’’’-dh-iGb3具有较iGb3更强的与抗原递呈细胞CD1d分子结合的亲和力及与NKT细胞TCR结合的稳定性。 三、4’’’-dh-iGb3能够上调Th1类细胞因子相关转录因子STAT1的磷酸化和T-bet的表达水平 予C57BL/6小鼠腹腔注射iGb3及其类似物或体外刺激小鼠的NKT细胞系,观察NKT细胞调控Th1/Th2类细胞因子表达相关转录因子的表达情况,发现与iGb3相比,4’’’-dh-iGb3能够上调NKT细胞调控Th1类细胞因子产生的转录因子STAT1的磷酸化和T-bet的表达,而调节Th2类细胞因子产生的转录因子STAT6的磷酸化和GATA-3的表达差异不显著。 结论(1) iGb3类似物4’’’-dh-iGb3能够诱导小鼠NKT细胞优势分泌Th1类细胞因子IFN-γ。(2) 4’’’-dh-iGb3可提高糖脂与CD1d、糖脂与NKT细胞TCR之间的稳定性和亲和力,从而促进NKT细胞的活化和Th1类细胞因子的分泌。(3) 4’’’-dh-iGb3可增强调控Th1/Th2分化的转录因子STAT1的磷酸化和T-bet的表达,从而促进NKT细胞IFN-γ的表达和分泌。(4) 4’’’-dh-iGb3可以作为新型免疫增强剂用于抗肿瘤和感染性疾病的治疗。
[Abstract]:Objective Natural killer T cells (NKT) are a special type of T lymphocytes capable of recognizing glycolipid antigens presented by non-classical MHC class I molecule CD1d and expressing NK and T cell surface markers NK1.1 and TCR.NKT cells via endogenous ligand sheath glycolipid iGb3 (isoglobotrihexosylceramide) and exogenous glycolipid binding. Activated human alpha-galactose ceramide (alpha-GalCer) can secrete many cytokines, such as IFN-gamma, IL-4 and IL-13, which play an important role in anti-tumor, anti-virus infection, autoimmune tolerance and autoimmune diseases. However, NKT cells can secrete both Th1 and Th2 cytokines, affecting iGb3 or alpha-GalCer. Glucolipid molecules will play a more extensive role in clinical application if effective ways can be found to actively regulate the relative production of two types of cytokines.
It was found that OCH, an analogue obtained by truncating the saddle alcohol chain of alpha-GalCer, could achieve the predominant secretion of IL-4 by lowering the stability of glycolipid molecule-CD1d complex and enhancing the affinity of glycolipid molecule-TCR. The analogue alpha-C-GalCer can prolong the time of interaction with C D1d and NKT cells by enhancing the stability of the links between the various parts of glycolipid molecules to achieve the predominant secretion of IFN-gamma. It is suggested that targeted modification of glycolipids can induce the secretion of Th1/Th2 cytokines in NKT cells. The functional and structural differences of NKT cells activated by glycolipids and lipids after modification were analyzed. However, there is no study on the modification of endogenous ligand iGb3.
In view of this, we modified iGb3 and alpha-GalCe, and obtained a number of chemically modified iGb3 and alpha-GalCe analogues. In the previous work, we screened two analogues 4-HO-iGb3 and 4''-dh-iGb3, which had the predominant ability to induce the secretion of Th1 cytokines in mouse liver NKT cells. The predominant secretion of cytokines from chemically modified iGb3 analogues was selected and determined. On this basis, the interaction between glycolipids/APC/TCR and some important factors affecting the secretion of NKT cytokines, such as cell microenvironment, were discussed in depth, which provided a new strategy and basis for the design and clinical application of glycolipids.
Methods (1) The number of NKT cells and the expression of intracellular cytokines IFN-gamma and IL-4 in liver and spleen of mice were detected by flow cytometry. (2) Differentiation and maturation of mouse bone marrow-derived dendritic cells were induced in vitro. (3) ELISA assay. The secretion levels of cytokines IFN-gamma and IL-4 in serum and cell culture supernatant of mice treated with chemically modified iGb3 analogues were measured. (4) The gene expression of IFN-gamma, IL-4, GATA-3 and T-bet in splenic lymphocytes of mice was detected by real-time quantitative PCR. (5) QSAR software was used to analyze TCR receptors on glycolipids and NKT cells and CD1d on APC cells. (6) The expression of T-bet and GATA-3 in spleen lymphocytes of mice was detected by Western blot.
Result
First, the predominance of chemically modified iGb3 analogue 4'''-dh-iGb3 induces the secretion of IFN-gamma by mouse liver and spleen NKT cells
Intraperitoneal injection of iGb3 and its analogues into C57BL/6 mice showed that chemically modified iGb3 analogue 4'''-dh-iGb3 did not increase the proportion and number of NKT cells in the liver and spleen, but significantly increased the expression of IFN-gamma in the NKT cells of the liver and spleen, the secretion of IFN-gamma and the level of IFN-gamma in the serum, and the expression of Th2 cytokine IL-4. The expression of cytokines in NKT cells and the content of cytokines in supernatant were detected by stimulating NKT cell lines in vitro with bone marrow derived DC loaded with glucose and lipid.
Two, 4 '' -dh-iGb3 can enhance the binding strength and stability between glycolipid and CD1d, glycolipid and NKT cell TCR.
QSAR software was used to simulate the spatial structure of glycolipid, CD1d molecule of antigen-presenting cells and TCR molecule of NKT cells on a computer. It was found that introducing HO into the saddle alcohol chain of iGb3 could form a hydrophobic bond, which could directly penetrate into the hydrophobic formation of CD1d molecule along with the existing HO in the original acyl chain. The affinity between the glycolipid and the amino acid Asp80 (C) on the C D1d molecule was enhanced by binding the sex antigen in the pocket, and the space position of the glycolipid binding to the amino acid Lys167 on the TCR molecule was changed from the one side of the glycolipid to the other side of the glycolipid by deoxidizing the glycolipid, so that the binding fraction between the glycolipid and the TCR was increased from 3.3 to 4.9, and the binding fraction between the glycoli The binding ability of 4''''-dh-iGb3 to TCR of NKT cells is that the modified 4'''-dh-iGb3 has stronger affinity to CD1d molecule of antigen-presenting cells and stability to TCR of NKT cells than that of iGb3.
3,4'''-dh-iGb3 up-regulates the phosphorylation of Th1 cytokine-related transcription factor STAT1 and the expression of T-bet
After intraperitoneal injection of iGb3 and its analogues into C57BL/6 mice or stimulation of NKT cell lines in vitro, the expression of Th1/Th2 cytokine-related transcription factors regulated by NKT cells was observed. Compared with iGb3, 4'''-dh-iGb3 could up-regulate the phosphorylation of STAT1 and T-bet of Th1 cytokines produced by NKT cells. The phosphorylation of STAT6 and the expression of GATA-3, which regulate the production of Th2 cytokines, were not significantly different.
Conclusion (1) iGb3 analogue 4'''-dh-iGb3 can induce the predominant secretion of Th1 cytokines IFN-gamma. (2) 4''-dh-iGb3 can enhance the stability and affinity between glucose and lipid and TCR of NKT cells, thereby promoting the activation of NKT cells and the secretion of Th1 cytokines. The phosphorylation of STAT1 and the expression of T-bet, which control the differentiation of Th1/Th2, promote the expression and secretion of IFN-gamma in NKT cells. (4) 4'''-dh-iGb3 can be used as a new immunopotentiator in the treatment of tumor and infectious diseases.
【学位授予单位】：山东省医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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本文编号：2244316