人PTP1B真核载体在COS-7细胞中的表达及其体外抑制剂实验

发布时间：2018-10-05 15:56

【摘要】： 目的克隆人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因及构建真核表达重组体pcDNA3.1-hPTP1B,转染至猴肾成纤维细胞系(COS-7),表达的重组融合蛋白用亲和层析法纯化,初步进行了酶活性及抑制剂的实验。 方法通过设计5'端引物和3'端引物(分别含BamH,EcoRⅠ酶切位点),取2型糖尿病人(BMI＞28kg·m~(-2))抗凝外周血,淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。提取总RNA,以Oligo dT为引物,合成出cDNA第一链。以RT产物为模板,PCR扩增出PTP1B插入片段。酶切后定向导入pcDNA3.1/myc-His-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni~(2+)亲和层析柱纯化后,利用PTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B酶的活性。主要洲定:1.PTP1B活性与PTP1B浓度的关系;2.PTP1B活性与底物pNPP-Na_2浓度的关系;3.PTP1B活性与反应温度的关系;4.特异性抑制剂钒酸钠(Na_3VO_4)抑制作用的浓度依赖关系及抑制类型的研究;5.常用胰岛素治疗药物吡格列酮和二甲双胍对PTP1B酶有无抑制作用的试探性研究;6.中药老鹰茶对PTP1B酶的抑制性作用和浓度依赖关系。 结果从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bp PTP1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到pcDNA3.1/myc-His-B中。RT-PCR和免疫印迹表明转染成功。抑制剂研究表明:1.rhPTP1B的活性随酶浓度底物浓度增加而增加;2.在35℃左右,rhPTP1B的活性最大;3.钒酸钠对PTP1B的抑制作用呈浓度依赖性增强,PTP1B酶活性随钒酸钠浓度增加而减少,双倒数作图显示,钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;4.常用治疗糖尿病药物二甲双胍和吡格列酮对PTP1B酶并无明显抑制作用,而老鹰茶的总黄酮粗提物(TFLC)对PTP1B有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性增强。 结论已成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-hPTP1B,稳定转染到COS-7细胞中并成功表达,纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究。通过初步的抑制剂研究对影响PTP1B的活性的反应条件和一些抑制剂的抑制特点有所了解。
[Abstract]:Objective to clone human tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) gene and construct eukaryotic expression recombinant pcDNA3.1-hPTP1B, into monkey renal fibroblast cell line (COS-7). The recombinant fusion protein was purified by affinity chromatography. Methods 5 'end primers and 3' end primers (including BamH,EcoR 鈪，

本文编号：2253988