四种方案诱导人胎盘间充质干细胞向胰岛β样细胞分化

发布时间：2018-10-05 19:23

【摘要】：目的: 从人胎盘中分离、培养和纯化间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),探索四种诱导方案使人胎盘间充质干细胞(Human placenta mesenchymalstem cells,hPL-MSCs)分化为胰岛β样细胞。方法:1.胎盘间充质干细胞的分离、培养和鉴定 经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法,从胎盘组织中获取MSCs。采用流式细胞仪检测细胞表面标志以及测定细胞周期。RT-PCR检测SSEA-4的表达。诱导细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化,并以油红O染色、碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色进行鉴定。2.诱导胎盘间充质干细胞向胰岛β样细胞分化 方案1:①IMDM(含5%FBS)添加β-巯基乙醇(β-Me)诱导2d;②经消化后,以添加了激活素A、全反式维甲酸和2%B27的IMDM诱导2d;③用含100ng/mL表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和纤连蛋白(FN)的IMDM(含3%FBS)诱导5d;④在DMEM/F12(含3%～5%FBS)培养基中加入β细胞调节素(BTC)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)和尼克酰胺(NIC)诱导7～9d。 方案2:在方案1的基础上降低EGF用量(20ng/mL),不添加FN,未经过消化过程。 方案3:前3步和方案1相同,但最后1步采用高糖(添加相同的细胞因子)诱导。 方案4:构建含pdx-1基因的重组腺病毒载体,并于293细胞中包装出完整的腺病毒(pAdxsi-CMV-Pdxl)。以pAdxsi-CMV-Pdxl病毒感染hPL-MSCs,经消化后再以EGF、bFGF、肝细胞生长因子(HGF)、BTC、GLP和NIC进行诱导。 经诱导后的细胞用化学发光免疫法检测培养上清中胰岛素和C肽的分泌量,并进行胰岛素释放实验;RT-PCR检测胰岛相关基因的表达;免疫细胞化学染色检测诱导后的细胞是否表达PDX-1,Insulin和C肽;Western blot检测细胞内是否含有PDX-1和Insulin。3.诱导后的细胞在1型糖尿病小鼠体内的作用 采用链脲霉素一次性腹腔注射法制备1型糖尿病小鼠模型,将诱导后的细胞注射到小鼠右侧肾被膜下,观察小鼠血糖变化;移植术后第24d,摘除其右肾以观察血糖是否反弹,最后取小鼠的肾脏和胰腺进行免疫组化检测。结果:1.胎盘间充质干细胞的分离、培养和鉴定 胎盘MSCs表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CDl06、CDl4、CD40和HLA-DR。细胞周期分析显示92.6%的细胞处在G0/G1期。向脂肪细胞诱导10d后,油红O染色为阳性。向成骨诱导3w,碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色也均为阳性。而且hPL-MSCs能表达SSEA-4。2.胰岛β样细胞分化的鉴定 经过诱导后的细胞聚集形成胰岛样细胞团。RT-PCR显示诱导后的细胞表达胰岛相关基因。免疫细胞化学染色表明诱导后的细胞表达PDX-1,胰岛素和C肽。Western blot也证实诱导后的细胞含有PDX-1和胰岛素。 经方案1诱导后的细胞分泌胰岛素的浓度为(222.00±584.97)mU/L,与方案2(72.00:±27.75)mU/L、方案4(722.00±51 79.36)mU/L、MSC组(0.08±50.03)mU/L和空载体组(1.40±0.57)mU/L相比,差异有统计学意义(P0.05);方案3(226.00:±73.35)mU/L与MSC组(0.08±0.03)mU/L相比,差异也有统计学意义(P0.05)。方案1、方案2、方案3、方案4诱导的细胞以5.5mmol/L和25mmmol/L葡萄糖分别刺激1h后,刺激指数分别为4.69±2.18,2.40±1.04,3.49±1.70,4.91±1.80。 而经方案4诱导后的细胞分泌的C肽为(3.380±52.3lO)ng/mL,与方案1(0.447±0.381)ng/mL、MSC组(0ng/mL)和空载体组(0ng/mL)相比,差异有统计学意义(P0.05)。3.诱导后的细胞在1型糖尿病小鼠体内的作用 诱导后的细胞注射到1型糖尿病小鼠肾被膜后,血糖逐渐下降,但是在下降过程中,部分小鼠的血糖会出现波动。直到实验结束,实验组小鼠的血糖降至6-8mmol/L(方案4转基因组)或10mmol/L(方案1细胞因子组)。而对照组的小鼠血糖则持续处于高水平。实验组的小鼠被摘除右肾后,血糖迅速反弹。 胰岛素免疫组织化学染色显示,注射诱导细胞的小鼠肾被膜下有大量染成棕色的胰岛素阳性细胞;同时取出的小鼠胰腺显示胰岛数量仍然明显减少,胰岛内胰岛素阳性细胞极少。结论:1.胎盘中能分离出MSCs,而且能在体外扩增培养;胎盘MSCs表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CDl06、CDl4、CD40和HLA-DR;还能表达胚胎干细胞特异性标志之一的SSEA-4。2.胎盘MSCs在体外能向脂肪细胞、成骨细胞分化。3.四种诱导方案都能诱导胎盘间充质干细胞向胰岛β样细胞分化;其中以pAdxsi-CMV-Pdxl联合细胞因子诱导的方案最佳,能提高分化效率,稳定分泌胰岛素,并使糖尿病小鼠血糖降至正常水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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本文编号：2254578