猪皮肤来源前体细胞多能性的分子机制

发布时间：2018-10-10 14:57

【摘要】： 神经嵴细胞起源于背部神经管,然后迁移到不同的组织区域形成各种各样的细胞类型。神经嵴干细胞/前体细胞可以分离自胚胎发育期和成体期的不同组织:神经嵴外植体、坐骨神经、背根节、肠神经节、角膜、骨髓、触须垫、颈动脉体和心脏。皮肤来源前体细胞(skin-derived progenitors, SKP)来自于胚胎期神经嵴干细胞,并且存在于成体期。人、啮齿类和猪的SKP细胞具有多能性,能分化产生神经胚层和中胚层起源的子代细胞。但是,关于SKP多能性的分子机制尚不清楚。本研究首先从第40-50天猪胎儿皮肤组织分离表达绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)的猪皮肤来源前体细胞,证明其多向分化潜能,同时鉴定出关于其多能性和神经嵴起源的多种分子标志。其次,通过高通量基因芯片技术比较了猪SKP细胞和神经干细胞(神经球)的转录表达谱,同时比较了猪SKP细胞和SKP来源的类成纤维细胞(SKP-derived fibroblast-like cells, SFC)的基因表达谱。最后,通过基因功能注解和KEGG通路分析,发现了几种相关的细胞内源调控机制和外源信号通路,它们对调控SKP细胞的多能性起重要作用。一SKP细胞的多能性和特异性标志分子的表达 1本研究从第40~50天猪胎儿皮肤组织中分离了表达绿色荧光蛋白的SKP细胞,其在无血清和高浓度EGF和bFGF存在时可以形成悬浮的球形结构。 2通过RT-PCR证实了猪SKP细胞共表达多能性相关基因(POU5F1、SOX2、NANOG和STAT3)和神经嵴标志分子(p75NTR、TWIST1、PAX3、SNAI2、SOX9和SOX10),这与胚胎神经嵴干细胞的表达谱类似,说明猪SKP细胞的神经嵴源性。 3通过免疫荧光细胞化学染色发现猪SKP球中POU5F1、巢蛋白、纤连蛋白和波形蛋白阳性细胞的比例分别为12.3%、15.1%、67.9%和53.7%,这说明猪SKP球具有异质性。 4通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,猪SKP细胞分化培养物中存在表达微管蛋白β-III、神经丝蛋白M、GFAP、p75NTR和平滑肌肌动蛋白的阳性细胞。这说明猪SKP细胞可以分化产生神经(神经元和胶质细胞)和中胚层细胞类型(平滑肌细胞和脂肪细胞),证明其具有多向分化能力。 5通过使用不同的培养体系和实时定量PCR检测,发现四种转录因子(POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3)的表达水平在生长因子(EGF和bFGF)和FBS存在时有显著性差异。POU5F1、SNAI2、SOX9和PAX3可能是维持SKP细胞体外多能性的关键因子。?二猪SKP细胞和神经干细胞的基因芯片分析 1本研究从第40~50天猪胎儿大脑组织中分离了表达绿色荧光蛋白的神经干细胞/神经球(neurospheres),同时从同一个胎儿中分离了皮肤来源的前体细胞。它们在同一种培养液(DMEM/F12+B27+N2+EGF+bFGF)中可形成悬浮的球形结构。 2通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,猪神经干细胞可分化形成神经和胶质细胞后代,证明其具有多能性;而猪SKP在体外能分化成神经和中胚层来源的子代细胞。 3通过RT-PCR对猪神经干细胞和SKP细胞分析发现,它们都表达NANOG、STAT3、TWIST1、p75NTR、巢蛋白、纤连蛋白和波形蛋白。但是,猪神经干细胞表达较高水平的SOX2,而且也表达GFAP。然而,SNAI2只在SKP球中表达。这说明神经干细胞和SKP球有类似的表达谱,但是有各自特异的转录状态。 4通过高通量的基因芯片技术比较了猪SKP球和神经球的转录表达谱,发现SKP球高表达254个转录物,而神经干细胞有484个转录物高表达。进一步分析发现,SKP球和神经球共同高表达142个基因,他们分别涉及核糖体功能、紧密连接、间隙连接、细胞通讯、钙离子信号、ErbB信号、JAK-STAT信号以及MAPK信号等。 5在1336个筛选出的转录物中,发现在SKP球和神经球中72个转录物的表达水平在统计学上有显著性差异(P0.05)。这些差异表达的基因主要涉及生理过程、细胞过程、信号刺激反应、发育过程、生物过程的条件和行为。 6功能注解聚类分析发现猪SKP球和神经球共同高表达基因主要涉及以下功能:RNA结合、蛋白质的生物合成以及核糖体等。对SKP球和神经球差异表达基因功能分析发现,胶原蛋白异构体和核心蛋白聚糖在细胞通讯、皮肤发育、信号转导以及胞外基质作用等方面发挥作用。 7 KEGG通路分析发现,猪SKP球和神经球共表达基因涉及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解、紧密连接、间隙连接、嘌呤代谢、谷氨酸盐代谢、细胞通讯、MAPK信号、钙离子信号、ErbB信号和JAK-STAT信号等通路;而它们差异表达基因主要涉及ECM受体和TGF-β信号通路。细胞通讯信号整合ECM-受体相互作用和TGF-β信号通路,可能对于维持猪SKP球和神经球特异的干细胞性质起重要作用。三猪SKP细胞中胚层潜能的基因芯片分析 1猪SKP细胞在悬浮培养中形成球状结构,但是在血清作用下贴壁生长形成类成纤维细胞。通过体外诱导分化和免疫荧光细胞化学染色发现,在SKP细胞分化为SFC过程中,其神经分化能力逐渐丧失而仍保留中胚层分化能力。 2通过RT-PCR比较猪SKP球和SFC标志基因的表达,发现它们都表达NANOG和STAT3,以及神经嵴细胞分子标志TWIST1、SNAI2和p75NTR。然而,SOX10只在SKP细胞中表达,可能与SKP的外周神经分化潜能有关。 3通过对猪SKP和SFC细胞的转录表达谱分析发现在SKP分化为SFC细胞过程中共有401个基因的表达在统计学上有显著性差异(P0.05),其中,305个基因表达上调和96个基因表达下调。 4通过功能注解聚类分析发现,上调表达基因主要涉及结合功能、细胞过程以及代谢过程;下调表达基因比较重要的GO(gene ontology)功能是磷酸化蛋白和结合活性。 5通过KEGG和BIOCARTA通路分析发现,下调表达基因主要涉及突触蛋白、Rac1细胞运动信号通路、Ran对有丝分裂纺锤体的调控、Dicer通路以及蛋白转运到核内等内源性机制;而上调表达基因参与了一些外源性信号通路,例如ErbB通路、MAPK通路、ECM-受体相互作用、Wnt信号、细胞通讯和TGF-β信号通路。这些内源性机制和外源性的信号通路共同调节SKP到SFC的基因转录状态改变。 6为了验证基因芯片数据,本研究通过相对标准曲线法对14个差异表达基因进行实时定量qPCR分析。定量PCR使用在制作基因芯片时扩增的cDNA作为模板。实时定量qPCR数据与基因芯片数据的表达谱类似,证明了基因芯片数据的可靠性。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【共引文献】