转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究

发布时间：2018-10-12 15:45

【摘要】： 目的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)可被诱导分化为多种细胞,被认为是组织工程种子细胞的重要来源。在体外培养时,hBMSCs寿命有限,随传代次数增加其分化能力逐渐丧失,这限制了其在组织工程中的研究和运用。转基因技术迅速发展,使永生化细胞建立成为可能。本研究通过逆转录病毒载体将外源人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转入人骨髓间充质干细胞中,以建立永生化的人骨髓间充质干细胞。 方法通过脂质体将含有hTERT基因的逆转录病毒载体(pLEGFP-C1-hTERT)转入包装细胞PT67,G418筛选出表达病毒的阳性细胞克隆。选取3个细胞克隆,各自进行扩增培养。通过NIH 3T3对选取细胞的上清进行病毒滴度测定,确定最高病毒滴度。提取并扩增hBMSCs,用病毒滴度最高的上清感染第三代(P3)hBMSCs。G418筛选感染后的细胞,选取3个单克隆分别进行扩增培养。通过RT-PCR和Western Blot测定hTERT基因是否转入hBMSCs中并表达。对P3转导后的hBMSCs(hTERT-hBMSCs)在形态学,细胞表型,向软骨细胞诱导方面研究证明hTERT-hBMSCs仍保持转导前的特性。通过MTT法测绘转导前后hBMSCs生长曲线,观察hTERT基因转入后对细胞增殖的影响。通过TRAP-ELISA对hTERT-hBMSCs中端粒酶活性进行检测;通过平板克隆形成实验和裸鼠致瘤实验对hTERT-hBMSCs致瘤性方面进行研究。 结果通过RT-PCR和Western Blot检测,转导后hBMSC中有hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达,而未转导hBMSC中虽可测到hTERT基因弱的mRNA转录,但是没有测到蛋白的翻译。hTERT-hBMSCs在形态学上和hBMSC一样呈长梭形,但是由于转导有EGFP基因,前者有绿色荧光蛋白表达。通过流式细胞仪检测转导前后hBMSC表面抗原标记:CD29,CD71,CD106,CD45和CD34,结果为前三项抗原都是阳性,后两项为阴性。在功能学方面,通过向软骨细胞诱导,免疫细胞化学检测到转导前后的细胞都呈棕黄色,说明有软骨细胞特异性标记II型胶原蛋白表达。TRAP-ELISA检测到hTERT-hBMSCs中端粒酶活性,而没有测到未转导hBMSC中端粒酶活性。hTERT-hBMSCs增殖能力增加,现其传代数在50代以上。在体外平板克隆培养中,hTERT-hBMSCs和hBMSCs细胞克隆形成不仅数量少,而且细胞生长状态差,克隆形成率为0.83%和0.67%,低于正常细胞克隆形成率1%,而对照组恶性黑色素瘤细胞克隆数量多,细胞生长状态好,克隆形成率为57.4%,远远高于肿瘤细胞克隆形成率10%。在裸鼠致瘤实验中,阳性对照恶性黑色素瘤细胞接种于裸鼠背部皮下,三周后局部就形成的肿块,HE染色为恶性黑色素瘤细胞,而注射有hTERT-hBMSCs的部位观察两月未见肿物形成,局部皮下组织HE染色为皮下疏松结缔组织。 结论hTERT基因成功导入hBMSCs后不改变hBMSCs细胞形态,表面标记和分化功能,保持其向软骨细胞分化的能力。hTERT基因转入使hBMSCs端粒酶活性被激活,其细胞寿命延长。hTERT基因转入使hBMSCs没有向恶性转化。研究证明成功地建立功能正常的永生化hBMSCs,可为组织工程种子细胞的来源提供一种途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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