BaP诱导H2AX磷酸化及其对细胞核蛋白表达的影响

发布时间：2018-10-15 18:43

【摘要】： 多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是广泛存在于水、沉积物、土壤、植物和空气环境中的污染物，主要来源于工业废气、汽车尾气、油烟、吸烟、熏制食品等。PAHs是极其稳定的，所以造成环境的持续污染。苯并芘(Benzo[a]pyrene，BaP)是典型的强致癌性的多环芳烃类化合物，对其已有许多深入的研究报道。BaP通过机体代谢产生的BPDE(benzo[a]pyrene-7，8-diol-9，10-epoxide)是目前已知的最强的致癌物之一。BaP可阻断细胞生长分化调节的信号转导，与DNA形成加合物，导致DNA的断裂，诱导p53基因突变等等。但是就BaP可否诱导细胞产生DNA双链断裂(double strandbreaks，DSBs)的标记γH2AX(磷酸化的组蛋白H2AX)，报道不一。而且关于BaP诱导γH2AX产生的周期依赖性及参与形成γH2AX的激酶的研究也未见报道。此外，以往的研究结果仅在单方面揭示BaP可能的遗传毒性或致癌的机理。然而BaP诱导的遗传毒性与细胞应答，可能的致癌机理并不是由单一或几个基因造成的，癌变是多因素、多阶段的过程。单纯针对某一个基因开展工作，很难发现与癌症相关明确的机理。以基因组学和蛋白质组学为主的高通量扫描技术的出现为此研究提供了一种新的研究思路。通过分析一个生物过程中基因组或蛋白组的变化，可以全面地了解参与生物过程的相关基因，构建细胞应答网络，解析关键细胞信号转导通路，从而更深入地探讨其潜在的分子机制。应用此类技术，已对BaP所诱导的细胞应激反应进行了分析，并鉴定了一批应答基因和蛋白。但是作为一种主要以DNA为靶点的化合物，BaP诱导的DNA损伤，势必引起DNA修复应答，从而影响正常的基因表达，造成细胞内蛋白表达差异。因为参与DNA损伤应答的蛋白理论上都应在细胞核内，所以研究BaP对细胞核蛋白表达的影响可能会对理解其遗传毒性及癌变的机制提供更有效的信息。鉴于以上原因，本研究首先系统地探讨了BaP处理细胞后对细胞生存率和细胞周期的影响，及其造成的DNA损伤是否可诱导γH2AX的产生。本论文的第一部分中，通过应用HeLa细胞我们首先验证BaP是否可诱导H2AX的磷酸化。采用MTT法，检测BaP对HeLa细胞生存率的影响；流式细胞技术分析了BaP对细胞周期的影响。采用了免疫荧光染色及Western-blot方法，研究了BaP诱导γH2AX的时间及浓度效应及γH2AX产生与细胞周期的关系。在此基础上，进一步使用基因缺失的细胞系及激酶抑制剂，研究了参与BaP诱H2AX磷酸化的激酶。通过以上的研究发现，BaP只有在较高剂量和长时间处理情况下对细胞活力有影响；对细胞周期影响较明显，可使细胞滞留于S期。BaP在HeLa细胞中诱导γH2AX的产生，并具有显著的时间及浓度效应，且具有S期或G2／M期的依赖性。通过不同基因缺失细胞的研究发现，BaP同样也可诱导γH2AX的产生，而且PIKKs(phosphatidylinositol 3-kinase-like protein kinases)家族的主要成员，包括ATM(ataxia telangiectasia mutated kinase)、ATR(ATM and Rad3-related kinase)和DNA-PK(DNA-dependent protein kinase)，在功能上互补或重叠参与了这一过程。本论文的第二部分主要应用蛋白组学的方法系统分析了BaP对HeLa细胞核蛋白表达的影响。研究中我们使用10μmol．L~(-1)的BaP处理HeLa细胞6 h、12 h、24 h后，提取核蛋白，进行Bradford定量。样本进行双向电泳分析，使用GS-800扫描仪获取图像。运用PDQuest 7.1软件分析数字化图像文件，发现差异表达的蛋白点；胶内酶解后使用液相色谱-串联质谱(LC-MS／MS)分析差异点。结果发现，与对照组相比，，BaP处理引起128个蛋白点表达发生了显著性的改变，对其中易切取的差异点进行了质谱分析，最终鉴定了24种理论上符合的蛋白。进一步对其中鉴定的Lamin A和Bub3蛋白进行了Western-blot，共聚焦显微镜(Confocal microscopy)验证，结果与双向电泳结果一致。在鉴定的蛋白中，发现了数种与RNA剪接相关的蛋白，提示BaP处理可能诱导变异剪接的产生。因此，进一步以Fas与CD44为靶基因，采用RT-PCR方法，检测其变异剪接体的变化，发现BaP引起Fas可溶性受体变异剪接体的表达改变。以上研究为进一步了解BaP的遗传毒性及致癌机理提供了有益的信息，其中发现的DNA损伤应激反应中变异剪接现象值得更深入的研究。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【共引文献】