仿生电刺激在离体心肌细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用

发布时间：2018-10-20 11:23

【摘要】： 【目的】 研究仿生电刺激对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导作用及强度。 【方法】 1.按不同接种密度、血清浓度、首次换液时间及PH值分组接种MSCs,10天后进行活细胞计数,探讨其适宜的培养条件,采用MTT法绘制细胞的生长曲线,免疫组织化学化检测MSCs CD44、CD34表达情况,流式细胞仪检测MSCs生长周期。 2.采用两种不同次序的胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化方法(方法1 0.125%胰酶+0.1%Ⅱ型胶原酶混合液逐次消化心肌组织;方法2 0.1%Ⅱ型胶原酶单独消化心肌组织数次基础上再单用0.125%胰酶逐次消化心肌组织),分离新生大鼠的心肌细胞,比较两种消化方法获得心肌细胞数量及存活率的差别,同时进行心肌细胞体外培养,观察其形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定。 3.将骨髓间充质干细胞(经DAPI标记)与心肌细胞按固定比例共同培养(MSCs /心肌细胞共培养体系),按是否给予仿生电刺激分为非电刺激组和电刺激组,刺激组每日给予仿生电刺激2h,频率0.5Hz、脉宽5ms、电压10V(电流强度20μA),每组又以实验干预培养时间(3、5、7天)分为三个亚组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)。分别于实验的第3、5、7天观察各组细胞生长情况,细胞免疫荧光方法检测骨髓间充质干细胞cTnT的表达情况。 4.取传代生长状态良好的MSCs,吸弃DMEM低糖培养液,换上含胎牛血清的DMEM高糖培养液;给予仿生电刺激的为实验干预组(每天给予电刺激2h,刺激7天),没有给予仿生电刺激的为实验对照组;仿生电刺激的频率为0.5Hz,脉宽5ms,按照刺激电压强度5V、10V、20V(分别对应的电流强度为10μA、20μA、40μA)分为三个亚组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组);电刺激干预7天后,分别取实验干预各亚组细胞和对照组细胞行cTnT抗体免疫荧光染色,观察各组细胞有无出现心肌细胞特异性肌钙蛋白的表达。 【结果】 1.MSCs贴壁呈纤维样生长,细胞较佳接种密度为5×105/cm2,合适血清浓度为10%,较合适首次换液时间为48h,培养液较佳的PH值为7.2左右;MSCs经历生长停滞期、对数生长期、平台期;MSCs膜上存在CD44阳性表达,无CD34表达;流式细胞仪检测MSCs大部分处于静止G0/G1期。 2.两种不同次序消化方法心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,方法2细胞存活率高于方法1;分离的细胞体外培养可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上。 3.离体心肌微环境诱导MSCs中,仿生电刺激组细胞较非电刺激组生长良好,实验第5天非电刺激组骨髓间充质干细胞没有cTnT表达,电刺激组有少数骨髓间充质干细胞出现cTnT表达。实验第7天非电刺激组和电刺激组MSCs均有cTnT表达,电刺激组骨髓间充质干细胞cTnT阳性细胞率高于非电刺激组。 4.仿生电直接刺激骨髓间充质干细胞7天后,倒置显微镜下观察,各实验干预组及实验对照组的MSCs细胞均明显铺开生长,形态、大小不一;分别取实验干预的各亚组细胞(按刺激电压强度5v、10v、20v分为三个亚组)和对照组细胞行cTnT抗体免疫荧光染色,均未见有心肌特异性肌钙蛋白的表达。 【结论】 1.仿生电刺激可促进离体心肌细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化:使其更早出现心肌样细胞改变;提高大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的比率。 2.在我们实验研究的参数范围内,单独的生物电刺激尚不足以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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本文编号：2283016