EB病毒感染猪淋巴细胞的研究

发布时间：2018-10-21 15:25

【摘要】：背景 EB病毒(epstein-barr virus)又称人类疱疹病毒(Human herpesvirus4(HHV-4))。EB病毒主要感染人类B淋巴细胞和口咽上皮细胞,EB病毒与淋巴瘤、鼻咽癌以及胃癌的发生发展息息相关。鼻咽癌又称广东癌,具有明显的地域性。中国的鼻咽癌患者占世界的80%,而且集中在广东一带,特别是在珠江三角洲、西江流域一带。而欧美国家则较为少见；鼻咽癌可分为高分化型鼻咽癌、低分化型鼻咽癌和未分化型鼻咽癌。其中中国患者以低分化型或未分化型鼻咽癌为主,而欧美国家主要是以高分化型鼻咽癌为主。在绝大多数的低分化型和几乎所有的未分化型的鼻咽癌的活检组织中可发现EB病毒。然而在高分化型的鼻咽癌活检组织中EB病毒却较为少见。 EB病毒与淋巴瘤之间的关系研究已经越来越清楚。EB病毒进入B淋巴细胞的途径使通过CR2介导的。CR2分为膜内部分、跨膜部分和膜外部分,其中膜外部分是有15-16个短共有重复序列(SCR1-16)组成。EB病毒与人CR2结合的关键区域是人CR2上的SCR1-2与EB病毒的gp350结合。然而EB病毒与鼻咽癌之间的关系依然存在着许多问题有待解决。目前对于EB病毒到底进入鼻咽上皮细胞的具体途径还不清楚,在细胞水平上研究发现,EB病毒可以通过游离EB病毒形式直接感染鼻咽上皮细胞,也可以是感染EB病毒的淋巴细胞与鼻咽上皮细胞通过细胞与细胞接触形式感染鼻咽上皮细胞,而且这个途径EB病毒感染效率远高于直接感染途径。从第二种EB病毒感染鼻咽上皮细胞的途径,目前提出了一种鼻咽癌发生发展假说：EB病毒首先感染B淋巴细胞,人的鼻咽部组织中有丰富的淋巴组织,这样使得感染EB病毒的淋巴细胞与鼻咽上皮细胞接触,从而使鼻咽上皮细胞感染EB病毒。再经过多次的基因突变,最终发展为鼻咽癌细胞。EB病毒对鼻咽癌发生发展起到重要作用,但仍然有许多问题有待解决,目前认为EB病毒的LMP1、LMP2A等基因对鼻咽癌发生发展起到重要作用,其中LMP1已被确认为是一种癌基因。由于鼻咽癌发生的解剖部位隐匿,且鼻咽癌具有明显的区域性,在国际上研究相对较少,这造成目前鼻咽癌的发生发展有许多问题有待解决。这样,构建EB病毒相关的鼻咽癌动物模型对于研究EB病毒与鼻咽癌之间的关系,以及EB病毒在鼻咽癌的发生发展所起到的作用具有重要的意义。目前的鼻咽癌动物模型主要是以小鼠的鼻咽癌模型为主,然而鼻咽癌的猪动物模型还未曾有相关的报道。而且猪的鼻咽癌动物模型相对小鼠鼻咽癌动物模型有几大优势：1、有文献报道猪能够得自发性鼻咽癌。然而,未见小鼠自发性鼻咽癌的报道。2、猪与人之间在遗传水平上的同源性相对比小鼠的同源性更高。3、猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类相近。4、由于解剖结构的原因(小鼠鼻咽部较较为狭窄,成瘤之后容易引起窒息而死)猪的鼻咽癌模型比小鼠鼻咽癌模型在成瘤后生存时间更长。在构建猪鼻咽癌模型前需要先了解EB病毒与猪的亲和性。首先我们知道人淋巴细胞对EB病毒的亲和力比人鼻咽上皮细胞对EB病毒的亲和力更高,并且可以在体外用EB病毒诱导人外周血B淋巴细胞转化为永生化的B淋巴母细胞,而且目前认为EB病毒感染鼻咽上皮细胞是通过感染EB病毒的淋巴细胞通过与鼻咽上皮细胞间接触而感染；其次是猪外周血淋巴细胞相对鼻咽上皮组织取材更加容易。所以本文通过用EB病毒在体外感染猪外周血淋巴细胞,观察是否使猪淋巴细胞感染EB病毒,是否可以使猪淋巴细胞转化为永生化淋巴母细胞。来研究EB病毒对猪的亲和性。从而对构建EB病毒相关的猪鼻咽癌动物模型起到一定的指导意义。研究方法第一部分：EB病毒感染猪淋巴细胞 1、从B95-8细胞株(EB病毒转化的绒猴淋巴细胞)中提取EB病毒。 2、所提取的EB病毒分别感染猪、人外周血淋巴细胞以及小鼠脾脏淋巴细胞(研究表明EB病毒能够再体外转化人淋巴细胞,设为阳性对照；EB病毒不能在体外转化小鼠淋巴细胞,设为阴性对照)：首先用人淋巴细胞分离液分别从猪、人外周血淋巴细胞中分离出猪淋巴细胞和人淋巴细胞,以及用小鼠淋巴细胞分离液从小鼠脾脏研磨液中分离出小鼠淋巴细胞；然后再用EB病毒分别感染猪、人、小鼠淋巴细胞,此为实验组。未用EB病毒感染的猪、人、小鼠淋巴细胞为对照组；将实验组和对照组在同等条件下培养30天,在第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天的时候通过镜下观察各个实验组和对照组细胞的转化情况。提取DNA,检测EB病毒的感染情况。 3、构建CR2的表达载体,通过lipofectamine2000将CR2表达载体转入到猪和小鼠的淋巴细胞上。 4、EB病毒感染人淋巴细胞和表达CR2的猪淋巴细胞和小鼠淋巴细胞,此为实验组；EB病毒感染转染空载体的猪淋巴细胞和小鼠淋巴细胞为对照组1；无EB病毒感染的猪、人、小鼠淋巴细胞为对照组2。；细胞培养与EB病毒检测方法同第3步。第二部分：生物信息学对人、猪、鼠的CR2的分析 1、从NCBI中搜索出人CR2、猪CR2和鼠CR2的相应的cDNA序列和氨基酸序列。并且分别对人与猪、人与鼠的CR2的cDNA序列以及氨基酸序列进行比对两两比对,来分析人与猪、人与鼠的CR2在cDNA和氨基酸序列上的差异； 2、根据所检索的人CR2、猪CR2和鼠CR2的氨基酸序列,对相应的蛋白质的三维空间结构的结构预测。 3、EB病毒与人CR2结合关键区域：人CR2的SCR1-2和EB病毒的gp350。从NCBI中搜索SCR1-2和gp350的氨基酸序列；并且通过BLAST找出猪CR2和鼠CR2与人SCR1-2的同源序列。 4、根据所得到的猪CR2和鼠CR2与人SCR1-2的同源序列、人SCR1-2、gp350的氨基酸序列,进行相对应的蛋白质的三维空间结构的结构预测,并且找出结合的关键位点,以及找出为什么猪CR2和鼠CR2不能介导EB病毒。第三部分：EB病毒感染鼻咽癌细胞。 1、EB病毒通过两种途径感染鼻咽癌细胞株：选取两种鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2。用游离EB病毒直接感染CNE1和CNE2,此为实验组1；用B95-8细胞株分别和CNE1、CNE2共培养的接触感染途径,此为实验组2；并且设立对照组,即没有EB病毒感染的CNE1和CNE2。 2、上述的CNE1/CNE2的实验组1、实验组2和对照组进行细胞培养2周之后,采用PCR和Q-PCR方法检测CNE1/CNE2各组的细胞EBNA1基因,用来反映EB病毒感染情况； 3、检测感染后的细胞增殖,迁移能力：2周之后,收集细胞,用平板克隆形成实验来检测细胞的增殖能力、用细胞生长曲线实验来检测细胞的增殖能力；并且用划痕实验来检测细胞的迁移能力。结果 1、EB病毒能够感染人淋巴细胞,并使入淋巴细胞转化,而不能感染猪、小鼠淋巴细胞 EB病毒感染人淋巴细胞第13天出现克隆生长,并且可以多次传代仍然保持克隆生长,说明人淋巴细胞转化成功。PCR检测EBNA1为阳性；猪未出现克隆生长,但猪淋巴细胞聚集现象明显。PCR检测EBNA1为阴性；小鼠未出现克隆生长,但小鼠淋巴细胞未见聚集现象,贴壁现象明显。PCR检测EBNA1为阴性。 2、成功构建人CR2(hCR2)表达载体用PCR方法从pMD18-T-CR2载体上获取带BglⅡ和SalI限制性内切酶序列的CR2片段,将回收的CR2片段连接到用上述限制性内切酶酶切后的pEGFP-N1质粒上,对酶切鉴定正确的质粒进行测序,测序结果NCBI中进行blast比对结果是正确的。 3、猪和小鼠淋巴细胞在转染hCR2之后,能够被EB病毒感染用hCR2转染猪和小鼠淋巴细胞,再用EB病毒感染,western blot和Q-PCR检测hCR2,结果为阳性,说明转染成功；western blot和Q-PCR检测EBNA1,结果为阳性,说明EB病毒能够感染转染hCR2的猪和小鼠淋巴细胞。 4、信息学分析人CR2与猪CR2和鼠CR2存在差异通过BLAST比对发现人CR2与猪CR2、人CR2与鼠CR2在cDNA和氨基酸序列上存在差异；完整的人CR2、猪CR2、鼠CR2蛋白质三维空间结构存在差异；人CR2与EB病毒结合的关键区域SCR1-2的七个关键氨基酸当中,小鼠CR2与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Arg-89对应氨基酸为Lys；而猪CR2与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Lys-41对应氨基酸为Arg。 5、EB病毒通过细胞共培养途径感染鼻咽癌细胞效率高于EB病毒直接感染途径。 EB病毒通过细胞共培养途径和直接感染途径分别感染CNE1和CNE22周后,用western blot和Q-PCR检测EBNA发现共培养途径感染效率高于EB病毒直接途径。结论 1、EB病毒在正常情况下能够通过CR2感染人淋巴细胞,但是不能感染猪、小鼠淋巴细胞 2、猪和小鼠淋巴细胞在转染hCR2之后,能够被EB病毒感染。 3、人CR2与猪CR2和鼠CR2存在差异；小鼠CR2不被EB病毒感染可能是与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Arg-89对应氨基酸为Lys；而猪CR2不被EB病毒感染可能是与人SCR1-2同源比对中关键结合位点Lys-41对应氨基酸为Arg。 4、EB病毒接触感染方式使EB病毒感染CNE2/CNE2的效率高于EB病毒直接感染。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.11

【参考文献】