高氧损伤肺组织体外诱导骨髓间充质干细胞分化的研究

发布时间：2018-10-29 10:06

【摘要】： 第一章小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离扩增及鉴定目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells MSCs)体外分离、纯化及鉴定的方法。方法采用密度梯度离心法结合贴壁细胞培养法培养小鼠MSCs,观察不同代细胞的形态及生长情况,流式细胞术检测表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106的表达情况,并对小鼠MSCs进行纯度测定。结果：小鼠MSCs原代培养接种24小时后仅可见少许细胞贴壁,72小时后贴壁细胞数量逐渐增多,可见一些集落形成,此时贴壁的细胞形态为长梭形。在细胞培养的2-6天细胞增殖较慢,7-12天细胞增殖较快,呈“旋涡样”排列。细胞培养约两周左右,可接近80%-90%融合,细胞形态较为均一。传代后的小鼠MSCs24小时基本全部贴壁,呈梭形或星型样形态,传代培养后的细胞不再以集落方式生长,而呈均匀性分布生长。分离纯化后所得细胞活力为92.6±1.8%。流式细胞术结果显示第3代小鼠MSCs细胞均一性较好,在90%以上；CD34、CD45表达阴性,CD105、CD106表达阳性。结论：密度梯度离心法结合贴壁细胞培养法可成功培养出MSCs,所得小鼠MSCs活力及纯度均较高,流式细胞技术可以鉴定体外分离培养的小鼠MSCs。第二章肺组织与骨髓间充质干细胞体外非接触共培养目的建立肺组织与MSCs体外非接触共培养实验模型,探讨高氧损伤肺组织体外对MSCs分化及迁移能力的影响。方法出生1天新生小鼠置于60%氧浓度条件下饲养21天,建立支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia BPD)肺损伤模型。21天时脱颈椎处死取出肺组织,无菌条件下研磨、筛网过滤、胰酶消化、制备成肺组织单细胞悬液。共设定3组,transwell小室(PET膜孔径为0.4um)下室中为第三代小鼠MSCs,上室中分别随机放入高氧损伤肺组织单细胞悬液(实验组A)、正常肺组织单细胞悬液(实验组B)及空白培养液(对照组),进行体外非接触共培养。共培养6天做划痕实验、transwell小室侵袭实验,观察共培养后各组MSCs迁移能力的变化。共培养8天进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微下观察各组共培养体系下室SP-C、AQP5免疫荧光表达情况。共培养8天采用实时定量(Real-time)PCR,2-△△Ct方法定量分析共培养体系下室MSCs中表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)、转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA含量的表达。结果吸入60%氧气21天小鼠肺组织病理切片示：肺泡正常结构消失,肺泡腔直径明显扩大,肺泡数量减少,可见大面积肺泡融合,肺泡间隔增厚,大量间质细胞增生,BPD高氧肺损伤模型建立成功。划痕后培养12小时进行观察,三组均仅有少量细胞爬行至划痕中,24小时三组数目均有增加,但实验组A增加较明显,48小时实验组B及对照组迁移细胞数量明显少于实验组A。Transwell小室侵袭实验：培养48小时后,对小室下表面上的细胞计数,发现实验组A与实验组B或对照组相比较,穿过PET膜的细胞数目均有显著性差异。提示损伤肺组织共培养可以促进MSCs迁移能力的提高。共培养8天时免疫荧光结果：实验组A组可以见hoechst33342标记的蓝色荧光,AQP5的红色荧光, SP-C的绿色荧光；实验组B和对照组都仅见到hoechst33342标记的蓝色荧光,AQP5的红色荧光,而未见到SP-C的绿色荧光。共培养8天时Real-timePCR结果：SP-CmRNA在实验组A存在表达,但实验组B和对照组均未见有SP-CmRNA表达。AQP5mRNA、TGF-β1mRNA三组均有表达,实验组A与实验组B和对照组比较AQP5、TGF-β1mRNA的表达水平明显增加(P0.01)。但实验组B组与对照组表达水平无明显差异(P0.05)。结论成功建立BPD高氧肺损伤模型,以及体外非接触共培养诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型,并证实与损伤肺组织共培养后MSCs的体外迁移能力增强,损伤的肺组织可以促进小鼠MSCs诱导分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell AECⅡ)
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】