RAGE调节内皮细胞粘附连接及单层细胞膜通透性的分子研究

发布时间：2018-10-31 09:54

【摘要】：高级糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end product, RAGE)属于细胞膜上的免疫球蛋白超家族成员之一,与多种年龄相关性疾病有关,包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD),糖尿病和炎症性疾病。完整的RAGE蛋白包括一个细胞膜外高变区(V),两个稳定的膜外免疫球蛋白样(Ig-like)区域,一个跨膜区和一个短的细胞内区域。RAGE的高变区能与多种配体结合,从而活化细胞。RAGE的配体之一为β-淀粉样蛋白(amyloid P-peptide, Aβ), Aβ在阿尔茨海默病病人的脑中累积,是神经元内纤维缠结及脑实质中老年斑形成的病理基础。在Aβ与小牛肺部提取物结合位点的研究中,发现分子量为-50和-35KDa的蛋白条带均能与β-淀粉样蛋白结合,氨基酸序列分析发现两条分子条带都包含RAGE序列,其中后者为RAGE的细胞膜外区域(RAGE细胞内结构域缺失),是经蛋白酶水解后的RAGE片断,其功能为阻断RAGE与配体结合后的信号传导。进一步研究证明,在阿尔茨海默病病人脑组织、神经元、小神经胶质细胞和血管成分中RAGE表达增加,与β-淀粉样蛋白的累积部位相同。在体外细胞培养模型中,将β-淀粉样蛋白与转染RAGE的细胞共孵育导致细胞氧化应激的产生和NF-kB信号的活化。RAGE蛋白在血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)转运Aβ中有重要作用。然而,RAGE调节Aβ穿越血脑屏障的机制尚不清楚。为此,笔者运用稳定高表达人类RAGE蛋白的脐静脉血管内皮细胞系(ECV304)为模型进行研究,结果显示RAGE高表达导致细胞之间的粘附连接(Adheren junctions, AJs)受损,单层细胞膜的细胞旁通透性发生改变。进一步研究证明,RAGE蛋白高表达引起粘附连接相关蛋白β-catenin水平上调,F-actin细胞骨架的重塑和未成熟细胞粘附连接增加。此外,在RAGE稳定高表达的内皮细胞系中,随细胞密度增加的胞质紧密连接蛋白(ZO-1)水平上调被阻断,与之相应的细胞紧密连接(Tight junctions, TJs)受损,细胞旁通透性增加。在稳定表达细胞内结构域缺失RAGE (D/N-RAGE)的内皮细胞中并未观察到上述改变。表明RAGE调节内皮细胞通透性依赖其细胞内结构域的信号传导。 RAGE与其相应配体结合能引起细胞生物学性质(包括细胞增殖,炎性介质的产生,细胞移行以及细胞膜通透性)的改变。RAGE蛋白的高变区能与不同的配体结合,RAGE与配体结合后细胞活化的信号传导依赖于其细胞内结构域,但到目前为止,尚不清楚RAGE两个膜外Ig-like结构域的作用。为了研究RAGE各结构域在细胞膜通透性改变中的作用,在完整RAGE基因的基础上,构建了一系列能表达RAGE结构域蛋白的质粒：pcDNA 6.2-RAGE-△IgG (RAGE高变区缺失),pcDNA 6.2-RAGE-△IgC1 (RAGE膜外近N端Ig-like区缺失),pcDNA 6.2-RAGE-△IgC2 (RAGE膜外近C端Ig-like区缺失),并将其表达在内皮细胞系ECV-304,免疫荧光染色研究发现,RAGE-△IgG和RAGE-△IgC1蛋白分布在细胞质内,而全长RAGE, RAGE-△IgC2及D/N-RAGE蛋白分布于细胞膜上和细胞质内；在表达RAGE-△IgG和RAGE-△IgC1蛋白的ECV-304细胞中,其细胞骨架stress fiber与ECV-304细胞没有显著差别,而RAGE和RAGE-△IgC2表达的细胞,其stress firber显著减少。综上所述,RAGE蛋白在细胞膜上的表达增加,导致β-catenin水平上调,F-actin细胞骨架的重塑和未成熟细胞粘附连接增加,但依赖细胞密度增加的zO-1水平上调被阻断,细胞旁通透性增加,揭示在阿尔茨海默病及糖尿病血管病并发症中,RAGE在血管病病理发生的新机制,RAGE高变区及RAGE膜外近N端Ig-like区域可成为干预治疗细胞通透性增加的新目标。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【参考文献】