细胞毒性T细胞联合PD-L1单抗对肺癌免疫治疗的实验研究

发布时间：2018-11-03 08:35

【摘要】： 第一部分细胞毒性T细胞联合PD-L1单抗对肺癌作用的体外研究目的: 通过诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte ,CTL),观察CTL单独或联合PD-L1单抗对肺癌细胞的体外杀伤作用。方法: 采用70%Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),培养2小时后贴壁细胞采用含GM-CSF(100μg/L)、IL-4(50μg/L)、10%FCS的RPMI1640诱导树突状细胞(dendritic cells ,DCs),培养第6天,采用凋亡的H1299肺癌细胞进行肿瘤抗原负载(DCs:凋亡细胞=5:1),24 h后加入激发型CD40单克隆抗体(5mg/L)继续诱导2d,收集诱导成熟的DCs与自体T细胞按1:50的比例混合共育4天,获得相关抗原特异性的CTL细胞;用流式细胞仪检测CTL细胞表型;四甲基偶氮唑蓝(MMT)法测定CTL及CTL联合PD-L1单抗对肿瘤细胞的细胞毒作用;用Annexin-V、PI双染检测CTL单独及联合PD-L1单抗作用于H1299细胞的凋亡作用,Annexin-V联合CD3-PE单抗检测H1299细胞单独或联合PD-L1单抗对CTL细胞的凋亡作用;ELISA法检测不同组别CTL和H1299共培养上清液中IFN-γ,IL-2浓度。结果: 1.凋亡肿瘤细胞负载并经CD40激发型单抗5C11诱导分化成熟的DCs表面CD1α、CD83、HLA-DR表达上调(P0.05);2.与单独CTL组相比,CTL联合PD-L1单抗实验组能够更有效杀伤H1299细胞并能有效地诱导H1299细胞凋亡,CTL组及CTL联合PD-L1单抗组H1299凋亡率分别为(41.9±9.8) %、(63.2±11.7) % ,两者差异有统计学意义(P0.05);进一步研究发现PD-L1单抗联合CTL细胞促进CTL细胞分泌IL-2(162.3±20)pg/ml,与单纯CTL组(115.38±12.23)pg/ml相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论: 1.采用成熟凋亡肿瘤细胞负载的DC获得的CTL可有效杀伤H1299肺癌细胞,联合PD-L1单抗较单独CTL更为有效的杀伤肺癌细胞; 2.通过上述方法获得的CTL在H1299细胞作用下发生凋亡作用,联合PD-L1单抗可抑制H1299诱导的CTL细胞的凋亡; 3.CTL联合PD-L1单抗可促进CTL细胞分泌IL-2。第二部分细胞毒性T细胞联合PD-L1单抗对肺癌作用的体内研究目的: 观察细胞毒性T细胞单独或联合PD-L1单抗对裸鼠肺癌移植瘤模型的免疫治疗作用。方法: 建立人肺癌裸鼠异种移植瘤模型,荷瘤裸鼠随机分为4组:1.生理盐水治疗组;2. PD-L1单抗治疗组;3. CTL治疗组;4. CTL联合PD-L1单抗治疗组,观察荷瘤裸鼠体内肿瘤生长情况及体积大小;检测裸鼠血清中IL-10,IL-2水平的变化。结果: 1.在第51天,生理盐水治疗组、PD-L1组、CTL组、CTL+PD-L1单抗联合组荷瘤裸鼠肿瘤体积分别为(1.39±0.63)cm3、(1.53±0.71 )cm3、(0.63±0.26 )cm3和(0.16±0.03)cm3;CTL组、CTL+PD-L1单抗联合组肿瘤生长明显受抑制,与生理盐水组,PD-L1组相比,差异有统计学意义(P0.05);CTL联合PD-L1单抗组比CTL组肿瘤体积缩小更为明显,差异有统计学意义(P0.05)。 2.生理盐水治疗组、PD-L1组、CTL组、CTL+PD-L1单抗联合组IL-2水平分别为(160.5±44.9)pg/ml、(133.4±46.2)pg/ml、(321.1±24.1)pg/ml、(469.4±8.5)pg/ml,CTL组和CTL联合PD-L1单抗组IL-2水平明显升高,与生理盐水组,PD-L1组比较,差异有统计学意义(P0.05);IL-10水平分别为(556.4±94.5)pg/ml、(485.5±33.4)pg/ml、(335.9±27.3)pg/ml、(288.5±33.4)pg/ml,CTL组和CTL联合PD-L1单抗组IL-10水平明显降低,与生理盐水组、PD-L1组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论: CTL联合PD-L1单抗较CTL治疗组能有效抑制荷瘤裸鼠异种移植瘤的生长,肿瘤细胞分泌IL-10可能抑制了CTL的杀伤作用,PD-L1单抗可逆转此效应,促进CTL的杀伤活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】