【摘要】： 目的 干细胞,如胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)或间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)等,具有自我更新和无限增殖的能力,并能在特定因素的影响或诱导下向血、心肌、骨、神经、肝细胞等多谱系分化。因此,干细胞在临床上的应用非常广泛。但是,输注给病人的细胞数量只有达到7×107/kg时才能发挥有效的治疗作用,相对于成人,单份采集的干细胞数量远远不足以达到临床治疗效果,故体外大规模有效扩增是干细胞应用于临床细胞治疗及组织工程学的关键环节。迄今为止,胎牛血清(fetal bovine serum, FBS或fetal calf serum, FCS)因其含有较多的生长刺激因子和较少的生长抑制因子,仍是干细胞培养中应用最为广泛的生长添加剂。但作为异种蛋白质,它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外,应用FBS/FCS培养后的干细胞内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/108cells),可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应,从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来,现已有很多学者研究FBS/FCS的替代品,其中较多的就是应用人血清或血清衍生物来替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子)、脐血清等。脐血清是一种富含干细胞生长存活所需的不同的细胞因子的资源,对干细胞扩增更有刺激效应并维持细胞的未成熟状态。同时脐血清作为医疗废弃物,取自产妇分娩后,避免了胚胎等的伦理道德问题,故脐血清获得相对更容易且更广泛,且作为胎儿与母体的联接纽带,其免疫原性更低。因此本实验选择脐血清作为主要研究对象,对比其与胎牛血清的作用效果以及不同血型间的影响,为CBS在干细胞体外扩增中的应用,特别是临床应用提供实验依据。本实验中所采用的细胞-人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells, hPDMSCs)来源于正常足月分娩的胎盘,它具有和脐血相同的来源容易、广泛、免疫原性低等优点,所提取的间充质干细胞同骨髓间充质干细胞有相同的特性：自我更新和无限增殖的能力且能向多谱系分化等。本实验通过观察细胞形态、检测扩增细胞数量及所用时间、细胞周期以及培养前后细胞的表型、分化能力等方面的变化,对比胎牛血清与脐血清对人胎盘间充质干细胞扩增的影响的同时,进一步探讨了不同血型脐血清对不同血型同种异体人胎盘间充质干细胞扩增的影响。 方法 1、分离培养hPDMSCS取足月剖宫产胎儿胎盘子体面组织,PBS冲洗,剔除血管、神经,采用组织微块贴壁培养法分离培养hPDMSCs。 2、脐血清(CBS)的提取：无菌条件下无抗凝取健康产妇足月脐血,静置、离心、过滤,无菌检测后分装备用。 3、细胞培养与扩增：方案一：同密度(6000个细胞/cm2)接种,每代均培养相同的天数(3d-4d),作MTT检测,再同原始接种浓度的细胞吸光度进行比较得出增殖比率来绘制各代增殖曲线。方案二：初始以6000个细胞/cm2密度接种后各代均1：2传代,至细胞14d生长不足50%传代终止。分别计算累积群体倍增数(cumulative population doublings, CPD)和细胞传代时间(generation time)即细胞倍增的平均时间,检测细胞增殖情况。 4、细胞周期检测：取P2、P10细胞,流式细胞分析仪检测细胞周期。 5、细胞表面标记物与细胞分化能力检测：取培养前、后的hPDMSCs,流式细胞仪检测CD31、CD45、CD73、CD105、CD166的表达情况及诱导hPDMSCs向软骨、内皮方向分化。 结果 1、胎盘中提取的hPDMSCs形态：呈梭形或成纤维状,可持续传代生长。 2、人胎盘组织来源的细胞表面标记特征：CD105、CD166,不表达CD31、CD34、CD45。 3、hPDMSCs的扩增情况： (1) hPDMSCs形态：CBS培养后细胞较小、更像两端尖的纺锤形,同时细胞呈筛网状生长。CBS较FBS维持的较小形态代数更长。不同血型CBS间细胞形态无明显差别。 (2)培养后hPDMSCs增殖情况：取培养较典型的不同的MTT值绘制曲线,TBD组细胞传代数最少、峰值最低,以色列组次之,CBS组传代数最多、峰值最高。 (3)培养传代代数和增殖后细胞数量：CBS组细胞代数最长,ISA-FBS组次之,TBD-FBS组增殖代数最短,CBS组CPD均明显高于ISA-FBS和TBD-FBS组。CBS组与FBS组差别有显著意义(p0.05),不同血型CBS组间差别无显著意义(p0.05)。 (4)细胞周期流式分析：流式分析表明各组培养的细胞大部分处于G0/G1期,说明细胞有较强的增殖能力,P2代细胞分析无明显差异,P10代时CBS组处于G0/G1期更多,ISA-FBS组次之,TBD-FBS最低,FBS组与CBS组相比差别均有显著意义(p0.05)。 4、hPDMSCs表面标记特征及分化能力的变化：流式细胞仪检测细胞表面标记在CBS培养前后无明显改变。用CBS培养增殖后的细胞均可向软骨、内皮方向分化。 结论 1、脐血清与胎牛血清相比,在hPDMSCs的体外扩增中,具有更强的促进细胞增殖能力。 2、不同血型脐血清对不同血型来源的hPDMSCs体外扩增作用无显著差异(p0.05)。 3、脐血清扩增后hPDMSCs的干细胞表面标记,向软骨、内皮细胞分化潜能无变化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329.2
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2308780
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