【摘要】： 目的:高效表达重组人IL-31,从而制备IL-31抗体(多克隆抗体/单克隆抗体),探讨IL-31抗体拮抗皮肤炎症的作用,为研发IL-31抗体治疗性新药打下基础。方法:(1)培养工程菌株E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,离心收集菌体并超声破碎,用镍NTA琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白,定量后分装备用。(2)重组人IL-31蛋白溶液加等体积的佐剂完全乳化后免疫家兔,制备兔抗人IL-31多克隆抗体。并且经ELISA和Western Blot进行鉴定。(3)将IL-31多克隆抗体分为三个剂量10μg、20μg、40μg经皮下注射和受损皮肤直接涂抹的途径,对已经致皮肤炎症的Balb/c小鼠治疗7天,同时设置阴性对照组(未治疗组)和空白对照组,治疗后3天取治疗部位皮肤作石蜡切片进行HE染色观察组织学变化,同时定量检测小鼠血清中IL-6,IL-8,L选择素和MIP-3β等炎性细胞因子的变化。(4)分析并合成IL-31的优势抗原表位,合成多肽后与牛血清蛋白交联,免疫小鼠以制备单克隆抗体。采用Protein A亲和层析法纯化抗体,并且经ELISA和Western Blot进行鉴定。结果:(1)SDS-PAGE电泳证实获得了高纯度的纯化人IL-31蛋白。(2)用重组人IL-31蛋白疫苗免疫健康家兔,诱导出高滴度的特异性抗体,在免疫后4周达到高峰,5～6周稳定在高水平。采用盐析法初步纯化抗体,并且经间接ELISA法检测后的兔血清抗体效价为1:15000～1:20000,双向琼脂扩散效价为1:16。通过Western blot结果证明重组人IL-31蛋白能与抗IL-31多克隆抗体特异性结合。(3)小鼠皮肤组织切片HE染色显示,治疗组皮下和皮内均有炎症细胞浸润,并且呈现一定程度的剂量依赖性趋势,与阴性对照组比较,炎症细胞的浸润明显减少。(4)小鼠血清中炎性因子ELISA检测显示,涂抹组和注射组小鼠血清中IL-6、IL-8均明显低于阴性对照组(P＜0.05)。同一剂量进行两两比较,发现两种用药途径之间没有显著差异。涂抹组和注射组小鼠血清中L选择素均明显低于阴性对照组,高于空白对照组。经统计学分析,注射组与阴性对照组无显著性差异(p＞0.05)。涂抹组和注射组小鼠血清中MIP-3β平均值明显低于阴性对照组(p＜0.05)。治疗组同一剂量进行两两比较,发现两种用药途径之间没有显著差异。(5)通过间接ELISA法检测两株杂交瘤细胞诱生的腹水抗体效价分别为1:10000(8A1株)和1:20000(8C3株)。通过Western Blot检测兔血清抗体和两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与重组人IL-31蛋白特异性结合。通过间接ELISA法检测抗体亚型为IgG3。结论:(1)获得高效稳定表达的重组人IL-31蛋白,以此作为免疫原免疫家兔,获得到了效价较高的兔抗人IL-31多克隆抗体。(2)兔抗人IL-31多克隆抗体,使皮肤致炎的炎性细胞减少,使小鼠血清中炎症相关细胞因子明显降低,提示IL-31与特应性皮炎等皮肤炎症的发病机制有关,人IL-31多克隆抗体具有拮抗作用,本研究为IL-31多克隆抗体治疗皮肤炎症提供了依据。(3)筛选到两株杂交瘤细胞株,获得了特异性强、效价高的单克隆抗体,为后续IL-31的检测、生物学功能的研究和IL-31抗体药物的研发打下了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392.7
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