人巨细胞病毒感染的实验室检测及其与淋巴细胞亚群分类的关系

发布时间：2018-11-11 16:07

【摘要】： 人巨细胞病毒(HCMV)感染是器官移植术后的主要而危险的并发症之一,是引起移植受者死亡和移植器官失功的重要原因。HCMV是一种条件病原体,有证据表明大约有50%~90%的人曾感染过HCMV并携带有特异性的抗体。同其它疱疹病毒一样,HCMV对免疫力正常的个体不具有明显毒力,而在各种原因引起的免疫功能受到抑制的宿主中可以被激活而发生感染。器官移植受者术后预防及治疗排斥反应和移植物抗宿主病中使用了大剂量的免疫抑制剂,所以处于免疫低反应状态,易于发生HCMV活动性感染并导致患者移植器官失功甚至死亡。因此,如何快速而精确的诊断HCMV活动性感染已成为术后监测感染状况、及时给予抗病毒治疗以及判断预后的关键。 HCMV实验室检测包括以下几种方法:病毒培养及病理鉴定、血清特异性抗体HCMV-IgG和HCMV-IgM检测、HCMV-DNA的PCR检测、抗原学检测和HCMV基因学的检测等方法。根据临床应用的需要,目前常规的检测方法主要是通过血清特异性抗体HCMV-IgG和HCMV-IgM的检测和通过免疫荧光技术(IFA)对早期抗原pp65(CMV-Ag pp65)的检测来判断HCMV活动性感染。但是对HCMV晚期抗原pp67的研究涉及较少,其临床意义尚不明确。同时HCMV感染与细胞免疫状态的关系尚不清晰,对外周血淋巴细胞亚群的测定与HCMV活动性感染的诊断尚无统一的标准,其特异性与灵敏性缺乏同一性。本研究在此基础上,引入流式细胞技术(FCM)对CMV-Ag pp65进行检测和核酸基础序列扩增法(NASBA)、Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)技术对HCMV的晚期抗原pp67-mRNA进行检测,评价CMV-Ag pp65和pp67-mRNA对于诊断器官移植术后HCMV感染、发病以及预后的价值。同时结合外周血淋巴细胞亚群的测定,讨论病人细胞免疫状态和HCMV感染之间的关系,为临床准确有效的分析理解实验结果提供依据。一、CMV-Ag pp65和pp67-mRNA对移植术后HCMV活动性感染的诊断价值采集2005年9月~2006年5月的28例器官移植受者(其中肝移植8例、肾移植14例、骨髓移植6例;男16例,女12例;年龄19~54岁,平均38岁)EDTA抗凝血120份,每人至少采集3份连续的血液样本列为实验数据。术后1周、1个月分别用肝素或EDTA管采血5~7ml,立即送检。IFA检测移植受者外周血中CMV-Ag pp65, NASBA测定pp67-mRNA,绘制两组用于诊断HCMV的受试者特征曲线(ROC),比较两组曲线下面积(AUC)。结果发现在120份外周血样本中,42份样本CMV-Ag pp65阳性(CMV-Ag pp65阳性细胞≥1个/2×106WBC),23份样本pp67-mRNA阳性。而28例器官移植受者中,9例CMV-Ag pp65和pp67-mRNA均为阳性(其中3例CMV-Ag pp65和pp67-mRNA在同一时间发现阳性),8例pp65阳性而pp67-mRNA阴性,2例CMV-Ag pp65阴性而pp67-mRNA阳性。临床诊断为HCMV病患者4例。在HCMV感染早期无临床症状病毒潜伏期间, CMV-Ag pp65 ROC的AUC为0.9542,pp67-mRNA ROC的AUC为0.6611,因此CMV-Ag pp65抗原检测的灵敏度和特异性均高于pp67-mRNA。而在HCMV临床症状出现感染并治疗后期,CMV-Ag pp65 ROC的AUC为0.8300,pp67-mRNA ROC的AUC为0.9232,pp67-mRNA的灵敏度和特异性高于CMV-Ag pp65。根据ROC查得CMV-Ag pp65阳性细胞10个/2×105WBC为诊断HCMV活动性感染的标准临界值。二、器官移植受者外周血中CMV-Ag pp65的FCM检测采集2007年9月~2008年3月中的84例肾脏移植受者EDTA抗凝外周血共145份标本。采用IFA对CMV-Ag pp65进行检测,其检测的敏感性为100%,特异性为76.0%。采集9例肾脏移植受者EDTA抗凝外周血共16份标本。采用FCM对CMV-Ag pp65进行检测,其检测的敏感性为100%,特异性为54.5%。使用Fisher确切概率检验对IFA和FCM两种不同检测方法的检出效果进行比较,结果两种检测方法的检出效果无显著性差异(P=0.25200.05)。三、器官移植受者外周血中HCMV pp67-mRNA的RT-PCR检测采集2007年10月~2008年1月的38例肾移植患者(男24例,女14例;年龄17~73岁,平均47岁)的EDTA抗凝血68份。采用RT-PCR检测pp67-mRNA,其中3例患者的3份样本检出阳性(有2例病人的2份样本中CMV-Ag pp65检出阳性并有1例诊断为CMV病,有1例患者1份样本CMV-Ag pp65检出阴性)。四、器官移植受者抗HCMV抗体血清状况和淋巴细胞亚群分类与HCMV活动性感染的关系采集2006年9月~2008年2月的27例器官移植受者(其中肝移植3例、肾移植20例、骨髓移植4例。男20例,女7例,年龄20~54岁,平均37岁)外周血标本共27份。使用酶联免疫斑点技术检测血清特异性抗体HCMV-IgG和HCMV-IgM,其中所有患者的HCMV-IgG均为阳性,HCMV-IgM均为阴性。HCMV非活动性感染组的诊断标准:未感染组即HCMV-IgG阴性和隐性感染组即HCMV-IgG阳性但CMV-Ag pp65检测阴性或阳性细胞≤10个/2×105WBC;HCMV活动性感染组的诊断标准:HCMV-IgM阳性或外周血中CMV-pp65抗原阳性细胞 10个/2×105WBC。对27份样本的CMV-Ag pp65检测,7份样本阳性并且在临床均明确诊断为HCMV活动性感染。应用美国BD公司CELLQUEST软件分析淋巴细胞中CD3~+细胞、CD4~+细胞及CD8~+细胞的百分比,并计算每例患者CD4~+细胞与CD8~+细胞的比值(CD4~+/ CD8~+)。各组数值均用均值±标准差( (x|-)±s)表示,采用校正t检验对组间均值比较。非活动性感染组与活动性感染组CD3~+细胞百分含量分别为(75.96±8.18)%和(67.75±17.39)%,差异无统计学意义(P= 0.110.05);非活动性感染组与活动性感染组CD4~+细胞百分含量分别为(53.37±4.38)%和(29.25±9.38)%,非活动性感染组高于活动性感染组且差异有统计学意义(P= 0.00010.01);非活动性感染组与活动性感染组CD8~+细胞百分含量分别为(20.73±4.45)%和(36.12±15.60)%,非活动性感染组低于活动性感染组且差异有统计学意义(P= 0.00030.01);非活动性感染组与活动性感染组CD4~+/ CD8~+比值分别为(2.64±0.53)和(1.07±0.45),非活动性感染组高于活动性感染组且差异有统计学意义(P= 0.00010.01)。结论: 1.CMV-Ag pp65更适于早期HCMV活动性诊断,对于提示临床开始抗病毒治疗具有早期快速的意义,同时可以把外周血中CMV-pp65 Ag阳性细胞10个/2×105WBC作为诊断活动性HCMV感染的标准临界值;pp67-mRNA检测快速、结果准确,其阴性结果可作为结束抗病毒治疗的参考指标,两者联合监测HCMV,对于辅助临床诊断具有很好的价值。 2.使用FCM与IFA对CMV-Ag pp65进行检测的检出效果没有显著性差异。 3.使用RT-PCR可以对HCMV pp67-mRNA作出定性的判断。 4.非活动性感染组与活动性感染组中CD3~+细胞百分含量无明显差异,即T淋巴细胞的含量无明显差异,因此单纯检测CD3~+细胞对鉴别诊断无使用价值。HCMV抗原在体外主要刺激CD8~+细胞增殖,活动性感染组中外周血CD8~+细胞高于非活动性感染组,致使CD4~+细胞与CD8~+细胞比值下降,甚至倒置。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R450;R392;R446.6

【参考文献】