骨髓间充质干细胞向神经元方向诱导分化及其机制的实验研究

发布时间：2018-11-12 20:18

【摘要】：目的: 通过体外实验探讨β-巯基乙醇(β-ME)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元细胞方向诱导分化的作用,并对Notch信号通路在此诱导分化过程中的作用进行研究,从而为阐明MSCs定向诱导分化为神经元细胞相关机制提供理论及实验依据。方法: 1.骨髓间充质干细胞的分离和培养:成年雄性SD大鼠,于无菌条件下取双侧股骨和胫骨,剪除骨两端,用5ml L-DMEM冲洗骨髓腔,将含有骨髓的冲洗液经Percoll分离液离心分离,计数细胞调整密度,按1×109/L接种于培养瓶中,50 ml/L(体积分数)二氧化碳,37℃温箱中培养。倒置相差显微镜下观察原代、传代细胞的形态变化及生长状态。 2.骨髓间充质干细胞的诱导分化:细胞传至第5代后按照Woodbury方案进行预诱导和诱导。加入L-DMEM+1mmol/Lβ-ME+20%FBS预诱导24小时后,加入L-DMEM+5mmol/Lβ-ME进行正式诱导。按照不同的诱导时间分为3组:A组:单纯培养对照组;B组:正式诱导1小时组;C组:正式诱导5小时组。在倒置相差显微镜下对诱导前后细胞进行观察、照相。 3.神经元细胞的鉴定:对诱导前后细胞进行免疫组织化学SP法检测神经前体细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神经巢蛋白(Nestin)的表达,以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性,未着色为阴性。 4. MSCs诱导后的超微形态结构观察:应用透射电镜对诱导5h后的MSCs进行观察,并对比诱导前后MSCs各细胞器的变化。 5. MSCs诱导前后神经元特异表型蛋白的检测:分别提取三组细胞的总蛋白,用westernblot方法检测三组细胞NSE和NESTIN蛋白在诱导前后的表达变化。 6. Notch信号通路的检测:参照Trizol试剂说明书提取各组诱导前后细胞的总RNA,测定提取总RNA的纯度,采用Realtime-PCR测定三组细胞的Notch1、jagged1、Hes1、Hes5 mRNA的表达水平,建立Excel数据表应用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果: 1.各组MSCs贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形。传代后细胞形态和原代细胞相似,生长加快。 2. MSCs经诱导后细胞形态变化明显,胞体收缩成锥形、球形,突起增多,表现出神经元细胞样形态。诱导后5小时具有神经元细胞形态特点的细胞数量逐渐增多,形成双极或多极细胞,而且细胞的多个突起发出分支,相互交织成网,此时形态也不再发生明显改变,具有典型的神经元细胞样形态。 3.诱导后细胞神经元标志物的免疫细胞化学检测显示:诱导后5小时,NSE、NESTIN和GFAP的表达均呈阳性,提示四组细胞在诱导后均转化为神经元细胞。 4.透射电镜下可见诱导后细胞,突起明显,胞核大,呈圆形或椭圆形,居于胞体中心,核染色浅,以常染色质为主,核仁明显,细胞质内细胞器丰富,核周可见大量的粗面内质网和夹杂其间的核糖体及线粒体。 5. westernblot方法检测细胞诱导前后神经元特异表型蛋白的表达:与A组对照相比,B组和C组均呈现NSE、NESTIN蛋白的表达增强。(P0.05). 6.实时荧光PCR结果显示:三组细胞均表达Notch1、jagged1、Hes1、Hes5。三组细胞Notch1、Jagged1、Hes1、Hes5在诱导分化前后的表达有差异,差异具有统计学意义。结论: 1.全骨髓贴壁和密度梯度离心法可以获得较高活力的MSCs,传代及换液法可以使MSCs得到纯化并成功建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞培养增殖体系。 2.经形态学、超微结构及神经元细胞特异性表型蛋白的鉴定,在本实验培养诱导条件下,MSCs可体外诱导分化为神经元细胞。 3.在MSCs诱导分化为神经元细胞的过程中,伴随着Notch信号通路相关基因的调节改变,提示Notch信号通路可能参与了MSCs向神经元方向的诱导分化。
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【学位授予单位】：华北煤炭医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】