【摘要】： 目的探讨供体脾细胞及其输注途径以及联合抗CD154单克隆抗体(antiCD154 mAb,克隆号AH.F5)对非清髓性骨髓移植预处理方案建立异基因嵌合体的影响及诱导供体特异性免疫耐受的可能机制.方法Lewis(Rtl~l)大鼠为供体,Wistar(Rtl~u)大鼠为受体,SD大鼠为无关第三品系。按不同预处理方案将Lewis供鼠脾细胞(Sc)、骨髓细胞(BMc)悬液输注给Wistar大鼠。受鼠随机分为4组,每组20只:(1)Sc_外组:第0天(d_0)经受体外周阴茎背静脉输注2×10~8供鼠Sc;(2)Sc_门组:d_0经受体门静脉输注2×10~8供鼠Sc;(3)Sc_门+BMc_外组:d_0经受体门静脉输注2×10~8供鼠Sc,第3天(d_3)再经阴茎背静脉输注1×10~8供鼠BMc;(4)Se_门+anti CD154mAbq-BMc_外组:d_0经受体门静脉输注2×10~8供鼠Sc,2h后腹腔注射anti CD154mAb 3mg,d3再经阴茎背静脉输注1×10~8供鼠BMc。通过酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测脾细胞输注术后第20(d_(20))、40天(d_(40))Wistar大鼠血清IL-10和IFN-γ水平;通过d_(20)、d_(40)单向混合淋巴细胞反应(MLR),大鼠重组白细胞介素2(IL-2)逆转实验和d_(50)迟发性超敏反应(DTH)对受鼠耐受程度进行评估;通过流式细胞术对d_(20)、d_(40)受鼠脾、胸腺细胞中Rt1~(1+)嵌合比例进行测定,d_(100)对Sc_门+anti CD154 mAb+BMc_外组加做此项检查。结果Sc_外组血清细胞因子水平在两时间点均无变化,与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05);Sc_门+anti CD154 mAb+BMc_外组血清IL-10、IFN-γ水平在d_(20)分别为(42.01±4.87)pg/mL和(28.97±3.83)pg/mL,d_(40)分别为(40.19±a:5.30)g/mL和(25.89±4.30)pg/mL,其中IL-10浓度明显高于其它各组,差异有统计学意义(P＜0.01),IFN-γ浓度均处于较低水平,Th1/Th2平衡向Th2偏移;而Scn和Sc_门+BMc_外组细胞因子水平向Th1偏移。单向MLR中Sc_门+anti CD154mAbq-BMc_外组对Lewis供鼠脾细胞的刺激指数(SI)在d_(20)、d_(40)分别为(4.43±0.19)和(4.97±0.25),均显著低于其余各组(P＜0.01),加入外源性IL-2后可部分逆转其低反应性,但对第三方SD大鼠来源的脾细胞仍保持强烈增殖活性,SI值与阳性对照体系无显著性差异(P＞0.05)。DTH实验中只有Sc_门+anti CD154 mAb+BMc_外组表现为显著低反应性,其余各组脚掌厚度差值(FI)与正常对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。嵌合体检测结果表明Sc_外组在脾和胸腺中均不能形成嵌合体;Sc_门和Sc_门+BMc_外组在d_(20)能建立较低水平嵌合体,于d_(40)很快下降甚至消失;而sc_门+anti CD154 mAb+BMc_外组在d_(20)、d_(40)的脾和胸腺中均可形成稳定的高水平嵌合,并持续超过100天。结论单纯经外周静脉输注2×10~8供体sc不能诱导嵌合体和免疫耐受的形成;将其输注途径改为门静脉后,可诱导出受鼠轻度的免疫耐受状态,建立短暂(＜20天)、低水平(＜20%)的外周性嵌合体;在此基础上联合输注1×10~8供体BMc可部分增强耐受状态,延长嵌合体水平至40天,但仍不稳定;而只有加入anti CD154 mAb后才可显著增强BMc植入率,三者具有协同作用。外周嵌合体＞30%、中枢嵌合体＞20%是保证骨髓细胞发挥强大致耐受作用的基础。Sc_门+anti CD154 mAb+BMc_外预处理方案可能与Th1/Th2细胞因子偏移、T细胞克隆无能和克隆清除等多种机制有关,在无大剂量骨髓细胞、骨髓抑制剂和放射线参与下,可获得稳定的高水平异基因混合性嵌合体,成功诱导受体针对供体抗原的特异性免疫耐受。 目的为研究胰腺移植术后排斥反应提供实验手段,建立异基因大鼠全胰十二指肠移植(WPDT)模型,并探讨手术过程操作要点。方法在双套管+腹主动脉三通管外接法建模的经验基础之上改进动脉吻合方式,将供受体腹主动脉端侧吻合,供体门静脉与受体左肾静脉袖套吻合,供体十二指肠与受体小肠端侧吻合,成功建立Lewis→Wistar糖尿病大鼠异基因WPDT模型。记录STZ诱导糖尿病大鼠的情况,对移植成功的受鼠3次/周监测随机血糖,并记录存活时间(ST),术后第7天取材3只大鼠移植物行病理学检查。结果STZ诱导糖尿病大鼠成模率为85.7%,酮症酸中毒(DKA)发生率为5.6%,病死率7.4%。50只糖尿病大鼠行WPDT术式,44例移植成功,术后24h血糖由术前(22.83±4.37)mmol/L降至(6.36±2.18)mmol/L。其中有8例于术后3d内死亡,其余36例受鼠存活时间为6～16d,平均为(10.45±3.3)d,术后4d、7d、10d、13d血糖水平呈进行性升高,术后7～10d为死亡高峰,移植物病理改变呈典型的急性排斥反应.结论熟练显微技术,重视操作细节,是成功建立WPDT模型的关键因素。本法建立的WPDT模型可见到移植胰发挥内分泌功能以及典型的急性排斥反应病理改变,该模型稳定、可靠,适用于排斥反应的研究。
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【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.4
【参考文献】
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9 周峰,万赤丹,熊炯p，
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