新型肿瘤基因疫苗载体的构建及其抑瘤活性的初步研究

发布时间：2018-11-21 14:15

【摘要】： DNA疫苗有许多独特的优势,例如与重组蛋白或全肿瘤细胞疫苗相比,DNA疫苗易于操作的特点使它更易于大规模的生产;可同时编码多个免疫调节分子等。DNA疫苗的安全性在动物模型及人类临床试验中也得到了证实。更重要的是,机体很少出现中和质粒DNA的免疫应答,因此,DNA疫苗可以多次重复给药。DNA疫苗对肿瘤及感染性疾病的预防及治疗性作用在动物模型中已经得到了证实,直接接种编码肿瘤相关抗原的DNA疫苗能够诱导特异性的细胞及体液免疫应答,产生的CTL细胞及抗体介导的细胞毒作用能抑制肿瘤生长。然而,DNA疫苗应用于人体时还面临着许多困难,临床试验的结果总是不尽如人意。其中的原因之一是CD4~+T细胞不能有效的活化。免疫的DNA质粒进入机体后,所表达的内源性抗原将通过MHC I类加工途径递呈给CD8~+ T细胞。而CD4~+T细胞的活化对基因疫苗起着至关重要的作用:抗体类别转换,特异性B细胞、T细胞扩增,记忆细胞的形成及机体其他免疫功能发挥都需要活化的CD4~+T细胞提供共刺激分子及细胞因子。因此,将抗原分子直接带入MHCII类提呈途径(如内体、溶酶体)将使抗原由内源性加工提呈途径向外源性加工提呈途径转化,有效活化CD4~+T细胞,促进其提供共刺激分子及细胞因子。溶酶体相关膜蛋白(lysosome associated membrane protein, LAMP)属I型穿膜蛋白,主要定位于溶酶体外膜。新合成的LAMP分子通过C末端短胞浆尾中的识别序列YXX(?)((?)代表任意一亲水性氨基酸)能特异性的靶向输从细胞浆送至内体/溶酶体。人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)及Survivin是两个肿瘤相关抗原,在结肠癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等大多数肿瘤细胞中高表达,而在相应的正常组织中基本不表达。hCG及Survivin高表达与肿瘤的发生、发展、预后及耐药性密切相关。因此,基于这两种分子的各种疫苗用于相应肿瘤的免疫治疗。CTP37-DT是由β-hCG的C末端37个氨基酸与白喉类毒素(DT)相连制备的亚单位疫苗。最近,CTP37-DT作为治疗结肠癌的药物已经通过I期及II期临床试验。试验证实该疫苗是安全的并且能延长进展期结肠癌患者的生存期。而关于Survivin的体内及体外实验都证实,机体能产生针对Survivin多肽的特异性杀伤性T细胞,例如在乳腺癌、白血病及黑色素瘤患者体内都能检测到Survivin多肽特异性的MHC-I类分子限制的效应性T细胞。迄今为止,已经确定了多个由HLA-A*0201或HLA-A*0301限制递呈的表位,这些表位被用作特异性CTL应答的靶标。大量实验证实,新生血管的形成促进肿瘤的生长及转移。VEGF及其受体(尤其是vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)在生理性及病理性血管形成过程中发挥着重要的作用。VEGF及其受体在肿瘤组织中常常高表达,针对二者的抗体、免疫毒素、核酶、可溶性受体及小分子酪氨酸激酶抑制剂等在动物模型及临床试验中取得了良好的治疗效果。因此,VEGFR2是治疗肿瘤的又一理想靶标。VEGFR2的胞膜外区含有7个免疫球蛋白样结构域。第三个结构域在最小的配受体结合单位中至关重要,将其移除后将导致配受体结合功能的完全丧失;第四结构域在维持配受体的高结合力上起主要作用,删除第四结构域将导致结合率的骤减。因此,我们将编码β-hCG C末端37个氨基酸、Survivin的5个不同HLA限制性的CTL表位及VEGFR2包膜外区第三、第四结构域氨基酸的碱基拼接起来作为编码肿瘤复合抗原基因(HSV)并插入LAMP分子溶酶体内腔与穿膜区之间,构建DNA疫苗p-L/HSV,希望能通过LAMP分子的作用将肿瘤抗原靶向到MHC-II类提呈途径。用p-L/HSV及各组对照质粒免疫小鼠,共免疫三次,最后一次免疫后三周行ELISPOT及杀伤试验。ELISPOT数据提示,在肿瘤复合抗原人工合成的重叠肽(18aa /肽,重叠8aa)中,11、18、22、24号肽可刺激p-L/HSV组T细胞产生IFN-γ,且特异性T细胞数目明显高于相应对照组p-HSV(P0.05);当4、8、9号肽刺激时,p-L/HS组IFN-γ的分泌量显著高于p-HS组;p-L/V组可产生19、24号肽特异性T细胞分泌IFN-γ;相对于p-L/V组,p-L/HSV组产生更强的24号肽特异性免疫应答。杀伤试验中,当效靶比为50:l时,以1-4号混合肽加载P815细胞作为靶细胞,p-L/HSV组的杀伤率约为p-HSV组的4倍;p-L/HS组对加载1-4号混合肽的P815细胞的杀伤率显著高于p-HS组(P0.05);p-L/V组的特异性杀伤见于23-26号混合肽加载的P815细胞;当靶细胞为1-4号混合肽加载的P815细胞时,p-L/HSV组脾细胞的杀伤率亦显著高于p-L/HS组。间接ELISA结果显示,p-L/HSV组能产生针对1-4,10-14,15-18,23-26号混合肽的特异性抗体,且随着免疫次数的增加,抗体浓度逐渐增加,至第三次后达到最高值;p-L/HS组产生的针对hCG及Survivin的特异性抗体浓度(1-9号肽涵盖抗原HS)显著高于p-HS组;相对p-L/HS组而言,p-L/HSV组产生的1-4号肽特异性抗体显著增加(P0.05)。我们的实验证实,通过LAMP分子将肿瘤抗原靶向到MCH-II类加工、提呈途径中,可有效活化CD4~+T细胞,增强肿瘤DNA疫苗的细胞及体液免疫应答;抗血管生成与抗肿瘤实质相结合的肿瘤复合抗原作为疫苗的目的抗原能收到更好的免疫效果。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】