脂肪间充质干细胞向内皮细胞诱导分化及血管发生

发布时间：2018-11-23 20:57

【摘要】： 目的: 探索大鼠脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化及形成血管的潜能,并将脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合在生物材料丝素上埋植到SD大鼠体内,探讨丝素材料及细胞复合型丝素在体内促进血管内皮细胞生成及血管形成的可行性。 方法: 1.脂肪间充质干细胞(ADSCs)分离、培养、诱导、鉴定:取SD大鼠附睾旁脂肪组织,剪碎,用0.15%胶原酶Ⅰ型37℃消化45分钟,等量含15%小牛血清的DMEM培养液终止消化,2800转离心16分钟,取细胞沉淀种板中,在二氧化碳培养箱中培养。MTT法测定、绘制第3代ADSCs细胞生长曲线;激光共聚焦显微镜观察ADSCs在丝素上的生长情况。用血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)作为ADSCs的诱导因子,倒置显微镜观察细胞的生长、变化情况及Matrigel上成血管的形态学变化,流式细胞仪鉴定ADSCs与诱导的内皮细胞表面标记的表达,透射电镜观察所诱导的内皮细胞的超微结构。 2.丝素材料与Matrigel凝胶复合ADSCs及所诱导的内皮细胞在体内成血管实验:选取200g~300g 8周至12周龄SD雄性大鼠40只,随机分为五组:A1空白丝素对照组(n=8);A2 BrdU标记的ADSCS +多孔丝素材料组(n=8);A3 BrdU标记的ADSCs诱导成的内皮细胞+多孔丝素材料组(n=8); B1空白Matrigel立体培养基组(n=8);B2 BrdU标记的开始诱导的ADSCS + Matrigel立体培养基组(n=8)。麻醉后常规消毒铺巾,于大鼠背侧左右两侧各做两处皮下切口,长约1cm,按各分组情况分别埋入移植物,间断缝合切口。术后分批处死动物,收集标本,行HE染色组织学观察、免疫组织化学观察BrdU和FⅧ-Ag阳性细胞分布。 主要结果: 1.脂肪间充质干细胞(ADSCs)分离、培养、诱导、鉴定:原代ADSCs培养2h细胞开始贴壁,5~7d细胞长满板底,用0.25%胰酶-0.02%EDTA液消化后,进行传代培养,第3代ADSCs细胞形态呈均一长梭形。第3代ADSCs用MTT法测定、绘制的生长曲线呈缓慢生长期、对数生长期、而后进入平台期的表现。激光共聚焦显微镜下看到细胞在被扫射的每层丝素材料面上生长良好,细胞增殖多。倒置显微镜下观察到ADSCs用内皮诱导液诱导14d后,呈铺路石样结构。Matrigel复合ADSCs向内皮细胞诱导,24小时细胞迁徙成团有小足伸出,7d成网格状,13d后形成较长血管,22~30d见较长血管的厚度在增加且有分枝出现。流式细胞仪鉴定,第三代ADSCs呈CD44阳性、CD31阴性表达;ADSCs向内皮细胞诱导14d后,细胞呈现CD44阴性、CD31阳性表达,透射电镜下看到内皮细胞特有的W-P小体。 2.1组织学观察 A1组术后1w丝素材料中少量血管、纤维组织生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整。随着时间延长,丝素中血管生长增多,术后4w见较多血管、纤维组织沿丝素材料孔隙生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整。 A2组术后1w丝素材料中少量血管、纤维组织生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整。术后4w大量血管、纤维沿丝素材料孔隙生长,且可见到较多管径较大的血管。少量淋巴细胞浸润。丝素材料有少量降解。 A3组术后1w丝素材料中有较多血管、纤维组织生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整。术后4w可见丰富的血管、纤维沿丝素材料孔隙生长,不仅有较多管径较大的血管,且存在丰富的毛细血管。淋巴细胞浸润较前减少。丝素材料有少量降解。 A1、A2、A3组都可观察到随时间延长,丝素材料与周围组织交界区域血管数量逐渐增加。 B1组术后1w少量血管生长,未见纤维组织,很少淋巴细胞浸润。Matrigel凝胶与周围组织无明显界限。术后4w大量血管生长,很少淋巴细胞浸润。不能观察到Matrigel凝胶。 B2组术后1w较多血管生长,未见纤维组织,很少淋巴细胞浸润。Matrigel凝胶与周围组织无明显界限。术后4w有丰富的血管生长,且可见到较多管径较大血管。很少淋巴细胞浸润。不能观察到Matrigel凝胶。 2.2 BrdU、FⅧ-Ag阳性细胞分布情况 术后1w、2w、3w、4w在A2、A3、B2组中均可见到不同密度的BrdU阳性细胞。随时间延长,BrdU阳性细胞数逐渐增加。 术后1w、2w、3w、4w在A1、A2、A3、B1、B2组中均可见到FⅧ-Ag阳性细胞,术后4w FⅧ-Ag阳性细胞在A1、A2、A3、B1、B2中的阳性细胞数分别为(25.08±8.35/HP)、( 30.05±7.59/HP )、( 36.12±12.58/HP )、( 25.24±9.41/HP )、(32.09±13.14/HP), A2、A3组阳性细胞数较A1组明显增多,差异有统计学意义(P0.01)。A3较A2组阳性细胞数明显增多,差异有统计学意义(P0.01)。B2较B1组阳性细胞数明显增多,差异有统计学意义(P0.01)。A3与B2组阳性细胞数差异没有统计学意义(P0.05)。 主要结论: 在体外,用加入VEGF和b-FGF的诱导培养液对ADSCs进行定向诱导,可以使ADSCs诱导分化为内皮细胞。以Matrigel凝胶作为细胞外基质,种植ADSCs后进行内皮细胞定向诱导,可见到血管样结构生成,且在体外较长时间保持稳定结构和良好生长状态。多孔丝素材料在体内与体外与细胞或组织均有良好的相容性,在体内可促进ADSCs向血管内皮细胞的分化及血管的形成。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 梁杰;银桂彬;彭智;罗少军;;血管生成素协同血管内皮细胞生长因子对自体脂肪移植血运重建的影响[J];中国美容医学;2007年07期

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本文编号：2352677