【摘要】： 缺血心肌恢复血流灌注过程中产生的心肌损伤,称为心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI),常见于冠心病等心血管疾病及体外循环下行开心直视手术、心脏移植、冠脉搭桥术、冠脉溶栓术及成形术等心血管疾病治疗过程。心肌缺血-再灌注损伤的发生涉及活性氧产生、钙超载及能量代谢障碍等机制,其结果是导致心肌细胞的死亡。核仁素是真核细胞核仁中最主要的一种磷酸蛋白质,具有多种生物学功能,可调控核糖体的生物合成与成熟,调控细胞增殖、生长、调控胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程。作为一种穿梭蛋白和细胞表面受体,核仁素参与多种物质在细胞核与细胞浆之间的转运以及细胞核功能的细胞外调节。近年研究表明核仁素还在细胞凋亡发生中发挥重要的调控作用。研究发现,在抗肿瘤药物、紫外线照射等所致的多种肿瘤细胞发生凋亡时,伴有核仁素蛋白的表达下调、断裂和转位改变,而核仁素过表达则导致细胞凋亡减少,并进一步发现核仁素是通过对凋亡相关分子如Bcl-2等mRNA稳定性的调控而发挥作用。然而,在心肌缺血-再灌注损伤所致的心肌细胞凋亡中,核仁素是否发挥作用及怎样发挥作用,目前尚无相关研究。 本研究首先观察了大鼠缺血-再灌注损伤心肌中,细胞凋亡的发生及核仁素的表达情况；然后探讨了核仁素对过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)所致大鼠心肌细胞凋亡的影响；并进一步探讨了核仁素影响凋亡发生的具体机制。主要的实验结果如下： 1、核仁素在大鼠缺血-再灌注损伤心肌中的表达 (1)大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型的构建：结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支30分钟后再灌注不同时间,血清中谷丙转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)及肌酸激酶-M (creatine kinase, CK-M)明显增多,心肌组织中活性氧生成增多。这提示心肌缺血-再灌注损伤模型构建成功。(2)缺血-再灌注损伤对大鼠心肌凋亡的影响：心肌缺血30分钟后再灌注不同时间,心肌组织中caspase-3活性升高,TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling)检测发现缺血-再灌注损伤心肌中细胞凋亡发生增多,琼脂糖凝胶电泳分析发现缺血-再灌注损伤导致DNA-Ladder的形成。以上研究表明,心肌缺血-再灌注损伤导致细胞凋亡发生增多。(3)缺血-再灌注损伤对大鼠心肌中核仁素表达的影响：心肌缺血30分钟后再灌注不同时间,心肌组织中的核仁素mRNA及蛋白质水平明显降低,且核仁素蛋白发生断裂,即从110kD的全长分子断裂形成一约80kD的分子。上述结果表明心肌缺血-再灌注损伤导致细胞凋亡发生增多,核仁素表达下调并发生断裂。 2、核仁素对H_2O_2所致大鼠心肌细胞凋亡的影响 (1)核仁素在大鼠心肌细胞氧化应激损伤中的时空表达模式：将新生大鼠原代心肌细胞暴露于0.5mmol/L H2O2,发现核仁素的mRNA及蛋白质水平明显降低、核仁素蛋白发生断裂,且在正常情况下大部分核仁素分布在心肌细胞核,H_2O_2处理则导致核仁素向胞浆移位。(2)核仁素过表达对H_2O_2所致大鼠心肌细胞凋亡的影响：应用核仁素真核表达载体转染大鼠心肌细胞,发现核仁素过表达能明显抑制H_2O_2所致的心肌细胞caspase-3活性升高及细胞凋亡发生。(3)核仁素低表达对H_2O_2所致大鼠心肌细胞凋亡的影响：应用RNA干扰技术抑制核仁素的表达,则发现核仁素低表达能进一步升高H_2O_2所致的的心肌细胞caspase-3活性及凋亡发生。以上结果表明,在H_2O_2所致大鼠心肌细胞损伤中,核仁素表达下调并发生断裂,核仁素对H_2O_2所致的大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用。 3、核仁素抗心肌细胞凋亡的机制研究 (1)核仁素不同结构域对H_2O_2所致的大鼠心肌细胞凋亡的影响：由于在核仁素的氨基端分布有其酶解位点,我们推测氧化应激损伤时形成的80kD核仁素分子是切除了氨基端的核仁素片段,因而我们选用了核仁素氨基端(AA1-309)和核仁素羧基端(AA310-713)两个突变体来探讨核仁素抗凋亡的可能机制。将核仁素不同结构域的表达载体转染大鼠心肌细胞后,发现单纯转染对caspase-3活性及细胞凋亡发生率无明显影响；H_2O_2处理后,caspase-3活性及细胞凋亡发生率明显升高,转染核仁素氨基端片段(AA1-309)后caspase-3活性低于转染空载体心肌细胞组,而转染核仁素羧基端片段(AA310-713)后,心肌细胞caspase-3活性及凋亡发生率则明显高于转染空载体心肌细胞组。这提示核仁素氨基端(AA1-309)具有部分抗凋亡作用,而核仁素羧基端(AA310-713)则具有促凋亡作用。 (2)核仁素及其不同结构域对凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响： 将核仁素RNA干扰片段、核仁素全长或其不同结构域表达载体转染心肌细胞,发现抗凋亡基因Bcl-2在核仁素过表达心肌细胞中表达明显上调,在RNA干扰所致核仁素低表达的心肌细胞中明显下调,但在核仁素氨基端片段(AA1-309)或羧基端片段(AA310-713)过表达细胞中,Bcl-2表达水平与对照组细胞没有明显差异。而促凋亡基因Bax则在核仁素过表达心肌细胞中表达明显下调,在核仁素低表达心肌细胞中明显上调；Bax在核仁素氨基端片段(AA1-309)过表达细胞中的表达无明显改变,而在核仁素羧基端片段(AA310-713)过表达细胞中,Bax表达增高。上述结果提示核仁素可促进Bcl-2的表达并抑制Bax的表达,而核仁素羧基端(AA310-713)则促进Bax的表达。 H_2O_2处理后,心肌细胞中Bcl-2表达下调,核仁素过表达可抑制H_2O_2所致的Bcl-2表达下调,核仁素RNA干扰可促进H_2O_2所致的Bcl-2表达下调,但核仁素氨基端片段(AA1-309)或羧基端片段(AA310-713)过表达对H_2O_2所致的Bcl-2表达下调没有明显影响；与此相反,H_2O_2处理导致心肌细胞的Bax表达上调,核仁素过表达可抑制H_2O_2所致的Bax表达上调,核仁素RNA干扰或核仁素羧基端片段(AA310-713)过表达可促进H_2O_2所致的Bax表达上调,但核仁素氨基端片段(AA1-309)过表达对H_2O_2所致的Bax表达上调没有明显影响。以上结果说明在H_2O_2所致的大鼠心肌细胞损伤中,核仁素通过增加Bcl-2表达、减少Bax表达而抑制心肌细胞凋亡；核仁素羧基端(AA310-713)则通过增加Bax表达而促进心肌细胞凋亡。 (3)核仁素及其不同结构域对凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA稳定性的影响： 收集放射菌素D处理后的不同心肌细胞组,用real-time RT-PCR检测mRNA水平,发现正常情况下核仁素过表达对大鼠心肌细胞中Bcl-2 mRNA稳定性没有明显影响,核仁素低表达则导致心肌细胞的Bcl-2 mRNA稳定性降低；经H_2O_2处理后,大鼠心肌细胞中Bcl-2mRNA稳定性降低,但核仁素过表达能抑制H_2O_2所致的Bcl-2 mRNA稳定性下降,核仁素氨基端片段(AA1-309)过表达则对H_2O_2所致的Bcl-2 mRNA稳定性的下降没有明显影响；上述结果提示核仁素通过增加Bcl-2 mRNA稳定性,使Bcl-2表达增多而抑制氧化应激所致的心肌细胞凋亡。 而核仁素过表达或低表达以及核仁素氨基端片段(AA1-309)过表达,对大鼠心肌细胞的Bax mRNA稳定性没有明显影响；但核仁素羧基端片段(AA310-713)过表达则明显增加了Bax mRNA的稳定性；经H_2O_2处理后,大鼠心肌细胞中Bax mRNA稳定性增高,核仁素过表达则明显抑制了H_2O_2所致的Bax mRNA稳定性增高。以上结果表明在H_2O_2所致的大鼠心肌细胞损伤中,核仁素通过降低BaxmRNA稳定性,使Bax表达减少而发挥抗凋亡的作用；核仁素羧基端(AA310-713)则通过增加Bax mRNA的稳定性,使Bax表达增多而发挥促凋亡作用。(4)核仁素与凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的相互作用：抽提正常或暴露于H_2O_2的大鼠心肌细胞裂解液,应用核仁素抗体进行免疫沉淀后,对沉淀物中的mRNA分子进行RT-PCR分析。结果表明,在正常大鼠心肌细胞中,核仁素可与Bcl-2 mRNA结合,心肌细胞氧化应激损伤时,核仁素与Bcl-2 mRNA结合减少；平行的Westernblot结果显示在正常情况下,主要为110kD的核仁素全长分子,H_2O_2处理后,110kD核仁素明显减少,形成大量的80kD断裂片段；以上结果提示核仁素可能是通过全长蛋白质分子与Bcl-2 mRNA结合而增加其稳定性。 与此相反,在正常大鼠心肌细胞中核仁素与Bax mRNA结合很少,心肌细胞氧化应激损伤时,核仁素与Bax mRNA结合增多；结合上述平行的Western blot结果,我们推论,与Bax mRNA结合的核仁素主要是80kD的片段。正常状态下,80kD的核仁素片段较少,氧化应激损伤时,核仁素80kD片段增多。该片段可能与Bax mRNA结合而增加后者的稳定性。 综上所述,核仁素是一重要抗凋亡蛋白,在心肌缺血-再灌注损伤中发挥重要保护作用。在缺血-再灌注损伤大鼠心肌及氧化应激损伤的心肌细胞中,核仁素表达下调且核仁素蛋白发生断裂,这可能是心肌缺血-再灌注损伤及氧化应激损伤发生的重要机制。在正常情况下核仁素大部分位于心肌细胞胞核,氧化应激损伤时核仁素向胞浆移位。在正常大鼠心肌细胞中,核仁素可与Bcl-2 mRNA、Bax mRNA结合；细胞氧化应激损伤时,核仁素与Bcl-2 mRNA结合减少、与Bax mRNA结合增多。氧化应激损伤时,核仁素全长蛋白分子通过与Bcl-2 mRNA结合增加其稳定性、与Bax mRNA结合降低Bax mRNA稳定性,从而增加Bcl-2蛋白表达、减少Bax蛋白表达而发挥抗凋亡作用；核仁素羧基端结构域(AA310-713)则通过增加Bax mRNA稳定性使Bax表达增多而发挥促凋亡作用。心肌缺血-再灌注损伤及氧化应激损伤可能通过减少110kD的核仁素全长蛋白质分子与Bcl-2mRNA结合,并增加80kD片段与Bax mRNA结合,使得Bcl-2 mRNA稳定性降低、Bax mRNA稳定性升高,从而导致凋亡的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363
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本文编号：2353688
