【摘要】： 日本血吸虫病至今仍是一种严重危害公众健康的公共卫生问题。我国每年要投入大量的人力、物力防治血吸虫病,但由于血吸虫保虫宿主多,钉螺分布广且难以消灭,再感染频繁发生,血吸虫病的流行形势仍十分严峻。上世纪70年代吡喹酮的问世,对血吸虫病具有很好的治疗效果,但并不能有效阻断血吸虫病的传播,再感染使化疗成本显得相对昂贵,且大规模反复化疗有产生抗药性虫株的潜在危险。由于血吸虫在终宿主体内不繁殖,只要能产生部分免疫保护作用就可有效降低成虫负荷,减轻由虫卵迟发型超敏反应引起的虫卵肉芽肿及其纤维化病变所致严重病理损害,同时减少虫卵对环境的污染,对控制血吸虫病的流行传播具有重要意义,因此需发展血吸虫病疫苗作为化疗的重要补充。DNA疫苗作为一种划时代的新技术,在抗血吸虫感染领域已进行了大量研究,显示了良好的应用前景。本实验室已构建的日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(TPI)DNA疫苗,免疫小鼠获得部分的保护作用,且在保虫宿主猪研究中发现除具有抗感染作用外,还能减轻宿主肝脏虫卵肉芽肿炎症反应,肉芽肿平均面积明显减小。TPI作为一疫苗候选分子,其抗原表位为血吸虫所特有,与哺乳类TPI无免疫交叉反应,避免了自身免疫的危险,但其免疫保护作用仍不很理想,推测其原因之一可能与该疫苗抗原分子在体内的表达量不高有关。由于宿主和寄生虫基因密码子使用上的偏性,外源抗原进入宿主后,外源基因似不能有效表达。据报道,对曼氏血吸虫的SmGPCR基因进行了密码子优化,可显著增加其表达量;在HIV和疟疾等的研究中也有类似结果。体内电穿孔是另一种提高目的抗原在细胞内表达的方法,其可通过提高DNA疫苗在体内的转染效率,进而提高抗原基因的表达,增强保护性免疫应答。热休克蛋白(HSP)是生物界普遍存在的一类高度保守蛋白质,具有分子伴侣作用并参与抗原提呈过程,并可利用其自身的免疫原性来诱导宿主免疫杀伤。HSP作为分子伴侣,甚至可直接将结合的多肽抗原递呈给T细胞,激活特异性CTL和记忆性T细胞,引发细胞免疫反应。本研究拟构建含有密码子优化的TPI基因和mHSP70基因的DNA疫苗,观察其免疫保护效果,同时进一步观察体内电穿孔技术对增强DNA疫苗免疫保护作用的效果,并初步探讨其作用机理,。本研究内容主要包括: 一、日本血吸虫TPI基因密码子优化 按照哺乳动物的密码子使用偏好,对日本血吸虫TPI基因进行优化,使用GeneOptimizer软件对SjCTPI基因的253氨基酸中的208个氨基酸编码基因进行优化,但不改变氨基酸。根据密码子优化后的基因序列,由德国GENEART公司全基因合成优化后的TPI基因(TPI.opt),然后插入pJW4303质粒。 二、血吸虫TPI基因密码子优化后的DNA疫苗的构建 根据TPI.opt碱基序列设计合成引物扩增TPI.opt,再插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,构建成重组质粒pcDNA3.1-TPI.opt。根据mHSP70碱基序列设计合成引物扩增mHSP70,插入质粒pcDNA3.1,构建成重组质粒pcDNA3.1-mHSP70。根据TPI.opt(去除终止密码子)碱基序列设计合成引物扩增TPI.opt,再插入重组质粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70基因的上游,构建成重组质粒pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70;根据TPI(去除终止密码子)设计合成引物扩增TPI,再插入重组质粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70的上游,构建成重组质粒pcDNA3.1-TPI-mHSP70。 三、血吸虫TPI基因密码子优化DNA疫苗免疫保护作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,A组(pcDNA3.1,空质粒对照组)、B组(pcDNA3.1-TPI)、C组(pcDNA3.1-TPI-mHSP70)、D组(pcDNA3.1-TPI.opt)和E组(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70)。各组小鼠分别肌肉注射相应的纯化质粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次。末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,42d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻击感染前2d取小鼠脾脏制备单个脾细胞,采用流式细胞仪法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。结果显示D、E组减虫率分别达到36.03%、39.03%,,减卵率分别达到41.71%、46.85%,均分别显著高于B(减虫率26.28%,减卵率28.35%)、C组(减虫率28.38%,减卵率31.39%)(P＜0.01)。B、C、D、E组小鼠血清都检测到特异性IgG及IgG2a,IgG1;IgG2a/IgG1的比值分别为1.73、2.06、2.44、3.09。D、E组小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF较B、C、组均有明显升高,但各组IL-4、IL-5均未检测到。表明TPI基因密码子优化后的DNA疫苗相对于未优化TPI DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较强的以Th1为主的免疫应答。 四、体内电穿孔技术增强密码子优化后的TPI DNA疫苗免疫保护作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,A组为(pcDNA3.1,空质粒对照组)、B组(pcDNA3.1-TPI.opt)、C组(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70),D组(pcDNA3.1-TPI.opt电穿孔)、E组(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70电穿孔)。各组小鼠分别肌肉注射相应的纯化质粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次,D、E组每次DNA疫苗免疫后即辅以体内电穿孔。末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,42d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻击感染前2d取小鼠脾脏制备单个脾细胞,采用流式细胞仪法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。结果显示D、E组减虫率分别达到49.74%、51.64%,,减卵率分别达到57.04%、61.42%,均非常显著高于B、C组(P＜0.01)。B、C、D、E组小鼠血清都检测到特异性IgG及IgG2a、IgG1;IgG2a/IgG1的比值分别为2.44、3.09、3.82、4.06。D、E组小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF较B、C、组均明显升高,但各组均未检测到IL-4、IL-5。本实验表明体内电穿孔技术可显著提高日本血吸虫密码子优化后TPI DNA疫苗的免疫保护作用,减虫率和减卵率均达到和超过50%。
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【学位授予单位】：江苏省血吸虫病防治研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392
【参考文献】
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