兔ADSCs与人HaCaT细胞体外共培养诱导成ESCs的研究

发布时间：2018-11-29 09:06

【摘要】： 研究目的: 应用共培养方法体外诱导脂肪来源干细胞(ADSCs)向表皮干细胞(ESCs)分化,探讨其作为组织工程化皮肤种子细胞的可行性。 研究方法: 1.选用兔龄3～4月大白兔,用贴壁法及Ⅰ型胶原酶法从脂肪组织中分离出细胞,进行体外长期传代及大量增殖培养,并观察及检测其生物学特性,以鉴定所培养细胞为脂肪来源干细胞(ADSCs)。 2.复苏人HaCaT细胞株,并体外扩增培养。 3.实验分组:①共培养3天的ADSCs;②共培养7天的ADSCs;③第三代ADSCs。采用插入式细胞培养器(Transwell)与六孔板来构建体外共培养模型,将HaCaT细胞和ADSCs分别种于上室和下室内进行共培养。对共培养后的ADSCs进行形态学观察鉴定,对3组细胞进行角蛋白K19,Pan-CK和β1整合素三个指标的免疫细胞学检测,并用SPSS15.0进行统计学分析。 研究结果: 1.ADSCs生物学特性:①原代及传代的兔ADSCs均呈长梭形或三角形贴壁生长,形态与骨髓间充质干细胞(BMSCs)相似。②传代的兔ADSCs生长曲线呈“S”形,群体倍增时间为22h～25h。③免疫细胞化学检测CD29,CD44表达阳性;而CD34,CD45表达阴性。 2.共培养后的ADSCs:①在形态上,共培养后的ADSCs细胞体积变大,横径变粗,由原来的细长梭型变成粗长梭型或短棒状,形态向表皮细胞系转化,并处于未成熟期;②在免疫细胞化学检测中,共培养后的ADSCs均表达角蛋白K19,Pan-CK和β1整合素阳性,共培养7天的较共培养3天的ADSCs表达抗体阳性率增高,且具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明共培养后的ADSCs为第三代ADSCs、表皮干细胞(ESCs)和暂时增殖细胞(TA细胞)的混合体。 研究结论: 1.胶原酶消化法可以获得纯度较高的ADSCs。 2.兔ADSCs与人HaCaT细胞体外共培养,可诱导向ESCs分化。 3.用Transwell体外构建HaCaT与ADSCs共培养模型,转化阳性率较高、避免交叉反应、简单易行、经济实惠。
[Abstract]:Aim: to induce the differentiation of adipose stem cells (ADSCs) into epidermal stem cells (ESCs) by co-culture in vitro, and to explore the feasibility of inducing adipose stem cells (ADSCs) to differentiate into epidermal stem cells (ESCs) as tissue engineered skin seed cells. Methods: 1. Three to four months old white rabbits were used to isolate the cells from adipose tissue by adherent method and type I collagenase method. The cells were subcultured and cultured in vitro for a long time, and their biological characteristics were observed and detected. Identification of Adipose-derived Stem cells (ADSCs). From cultured cells 2. Human HaCaT cells were resuscitated and cultured in vitro. 3. Experimental groups: 1 the third generation ADSCs. of ADSCs;3 co-cultured for 7 days with ADSCs;2 co-cultured for 3 days The co-culture model of HaCaT cells and ADSCs cells was established in vitro by inserting (Transwell) and six pore plates. HaCaT cells and ADSCs cells were cocultured in the upper chamber and the lower chamber, respectively. Morphological observation and identification of co-cultured ADSCs were carried out. Keratin K19 Pan-CK and 尾 1 integrin were detected by immunocytology in three groups of cells. SPSS15.0 was used for statistical analysis. Results: the biological characteristics of 1.ADSCs were as follows: (1) Rabbit ADSCs in primary generation and passage had long fusiform or triangular adherent growth, which was similar to (BMSCs) in bone marrow mesenchymal stem cells, and the growth curve of rabbit ADSCs in passage was "S" shape. The population doubling time was 22h~25h.3 immunocytochemistry to detect the positive expression of CD29,CD44. The expression of CD34,CD45 was negative. 2. In morphology of co-cultured ADSCs:1, the volume and transverse diameter of co-cultured ADSCs cells became larger and thicker, from the original slender spindle type to the coarse spindle type or short rod type. The morphology of the ADSCs cells transformed to epidermal cell line and was in immature stage. 2in immunocytochemistry, the expression of keratin K19Pan-CK and 尾 1 integrin in ADSCs was positive, and the positive rate of ADSCs expression in co-cultured for 7 days was higher than that in co-cultured for 3 days (P < 0. 05). The results showed that the co-cultured ADSCs was a mixture of the third generation ADSCs, epidermal stem cells (ESCs) and temporary proliferative cells (TA cells). Conclusion: 1. High purity ADSCs. can be obtained by collagenase digestion 2. Rabbit ADSCs and human HaCaT cells can be induced to differentiate into ESCs by co-culture in vitro. 3. The co-culture model of HaCaT and ADSCs was constructed with Transwell in vitro. The positive rate of transformation was higher, the cross reaction was avoided, and it was simple and economical.
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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本文编号：2364577