人及小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建与鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究

发布时间：2018-11-29 13:20

【摘要】： CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞等表面。Loetscher等于1996年首次从人CD4+ T细胞来源的cDNA文库中克隆出人CXCR3基因,基因编码区长度为1104bp,编码368个氨基酸,蛋白分子量为40.659 kD。目前已发现三种剪接变体,分别为CXCR3-A(即通常所说的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt;有三种CXC趋化因子配体与可之结合,分别为CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。近年研究发现,CXCR3在一些恶性肿瘤细胞表面高表达,通过受体-配体相互作用介导肿瘤的转移和侵袭。因此,本研究旨在克隆人和小鼠CXCR3基因,建立稳定表达人/小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配体作用下的迁移能力。以L929-huCXCR3作为免疫原和筛选细胞,建立能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以单克隆抗体作为工具,研究CXCR3信号通路对肿瘤转移和生长的影响。 第一部分人及小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建及鉴定 【目的】克隆人及小鼠CXCR3编码区全长基因,获得稳定表达人/小鼠CXCR3膜型分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3 ;研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配体介导下的迁移效应。 【方法】采用RT-PCR方法从活化的人外周血T淋巴细胞中扩增人CXCR3基因;同样方法从经Con A体内刺激、IL-2体外诱导培养的小鼠脾脏和胸腺细胞扩增小鼠CXCR3基因,分别插入逆转录病毒载体pEGZ-term。将重组逆转录病毒载体pEGZ-term/huCXCR3和pEGZ-term/mCXCR3分别与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,收集含完整逆转录病毒颗粒的293T培养上清,用其感染L929细胞,重复感染3次,经Zeocin加压筛选获得稳定表达人/小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3。采用免疫荧光和RT-PCR方法对L929-huCXCR3和L929-mCXCR3细胞进行鉴定;应用Transwell隔离小室系统研究基因转染细胞株在Mig、IP-10及I-TAC作用下的迁移效应。 【结果】获得了稳定表达人/小鼠CXCR3膜型分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,两种细胞内GFP和膜表面人/小鼠CXCR3分子的阳性表达率均在95.0%以上。L929-huCXCR3在人CXCR3配体的作用下可发生定向迁移,但所需的起始浓度不同、同等浓度下三种配体介导的迁移率也不同;L929-mCXCR3在50 ng/mL小鼠IP-10的作用下可发生定向迁移,并且抗小鼠CXCR3抗体对L929-mCXCR3的迁移具有抑制作用。 【结论】人及小鼠CXCR3基因转染细胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3的建立,为研究CXCR3信号转导的生物学功能、肿瘤转移模型的建立及抗人/小鼠CXCR3单克隆抗体的研制奠定了理论和物质基础。 第二部分鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究 【目的】获得持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以鼠抗人CXCR3单克隆抗体作为工具,研究人CXCR3分子的表达特性及CXCR3信号转导对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株的迁移及增殖的影响。 【方法】以高表达人CXCR3膜型分子的L929-huCXCR3细胞作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交技术,将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以L929-huCXCR3作为筛选细胞,转染空载体的L929-mock细胞作为阴性对照细胞,采用间接免疫荧光和流式细胞术,筛选能持续分泌抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用细胞核染色体计数、Ig亚类快速定性试纸法、间接免疫荧光以及Western blot对所获得的杂交瘤细胞株和单抗进行鉴定。用间接免疫荧光法分析CXCR3分子在肿瘤细胞表面的表达;Transwell隔离小室检测单抗对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29迁移的影响;MTT法分析单抗对结肠癌细胞株Colo205增殖的影响。 【结果】获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为9B5。经快速定性试纸分析显示,该单抗重链为IgG1亚类,轻链为κ链;间接免疫荧光和流式细胞术分析显示,单抗9B5可识别活化T淋巴细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT-29表面的CXCR3分子,并且可用于Western blot检测。通过阻断CXCR3信号转导,单抗9B5可抑制L929-huCXCR3细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116和HT29的定向迁移及IP-10对Colo205的促增殖作用。 【结论】成功获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究CXCR3的表达特性及深入探讨CXCR3信号转导在肿瘤生长与转移过程中的作用及机制奠定了物质基础,并且有望为治疗肿瘤转移提供新的思路和新型药物。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 宋芳;周玉;卢士英;任洪林;李岩松;柳增善;刘文迪;郝亚明;;β-酪蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J];中国实验诊断学;2011年08期

2 吕大伟;;抗体的临床应用及类风湿性关节炎的抗体治疗[J];中国医药指南;2011年22期

3 裴冀男;;单克隆抗体制备例谈[J];高中生学习(高二版);2011年05期

4 谢晓玲;;恶性血液肿瘤的单克隆抗体靶向治疗[J];中外医学研究;2011年18期

5 孙厚良;魏大鹏;张小洪;刘彦君;章崇杰;;抗hMOF单克隆抗体的制备与鉴定[J];四川大学学报(医学版);2011年05期

6 ;新药速递[J];药学与临床研究;2011年04期

7 罗莎;;单克隆抗体成功治疗由出血性大肠杆菌引起的溶血性尿毒综合症[J];基因组学与应用生物学;2011年03期

8 孔桂美;张小荣;黄瑶;高巍;廖月霞;卜平;;人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体研制与生物学活性测定[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2011年02期

9 曹黎黎;刘丹丹;卫娜;高明春;王君伟;;牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定[J];中国兽医科学;2011年07期

10 杜春红;王鹏;张建中;唐雪;宋志忠;;鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年09期

相关会议论文 前10条

1 徐爽;徐焱;;单克隆抗体在输血领域的应用探讨[A];中国输血1999年年会暨纪念ABO血型发现100周年学术交流论文专辑[C];1999年

2 李安民;;单克隆抗体标载的~(131)I治疗恶性脑胶质瘤Ⅱ期临床试验的三种给药途径的研究[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年

3 于翠;施曼铃;王桂珍;吴建祥;周雪平;;几种重要植物病毒单克隆抗体的制备和快速检测方法的建立[A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集[C];2003年

4 刘振勇;邓国华;李呈军;张立春;田国彬;何后军;于康震;陈化兰;;抗禽流感H9N2亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备与分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年

5 李振宇;赵益明;董宁征;沈飞;阮长耿;;抗FⅧ-C2区单克隆抗体的制备及鉴定[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

6 张改连;黄烽;;抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体rituximab治疗类风湿关节炎的临床研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年

7 郝波;张国新;林艳;杨杨;王宏娣;;抗HCCR单克隆抗体的制备及其在肝癌检测中的初步应用[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

8 陶薇;杨连华;何卓晶;洪艳;陈勇;;抗戊型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[A];浙江省医学会医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编[C];2009年

9 马翠卿;郭奕阳;顾海燕;曾瑞红;杨丽娟;魏林;;一株抗A族链球菌表面蛋白Fba的单克隆抗体对应的表位与Fba结合调节蛋白FH的位点重叠[A];河北省免疫学会第六次免疫学大会资料汇编[C];2010年

10 杨天兵;沈倍奋;;抗人重组白细胞介素1(rHIL-1)单克隆抗体的研制[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

相关重要报纸文章 前10条

1 文来;2010年单克隆抗体市场有望扩三倍[N];中国医药报;2005年

2 庄愉;单克隆抗体异军突起[N];医药经济报;2003年

3 ;单克隆抗体异军突起[N];中国高新技术产业导报;2003年

4 记者 尹晖;单克隆抗体研发进入新阶段[N];无锡日报;2010年

5 尹晖;最大单克隆抗体研制项目在马山奠基[N];无锡日报;2010年

6 记者 马波;滇将建首家单克隆抗体基地[N];科技日报;2000年

7 ;单克隆抗体应用前景看好[N];中国医药报;2002年

8 探微;单克隆抗体技术在中药研究中的应用初探[N];中国医药报;2006年

9 毛文波;单克隆抗体：征服癌症的新方法[N];科技日报;2004年

10 劳云信;单克隆抗体 抗击肿瘤的生力军[N];中国医药报;2004年

相关博士学位论文 前10条

1 唐琳;肝再生增强因子与肝癌发生、发展关系的研究[D];重庆医科大学;2005年

2 侯桂华;巨噬细胞移动抑制因子在同种移植排斥中作用及其机理的研究[D];山东大学;2004年

3 高勇;新型单克隆抗体荧光探针染料的合成及免疫荧光组织化学应用[D];西北大学;2006年

4 江敏;大鼠单克隆抗体的制备、鉴定、基因克隆、抗原分析以及药物偶联物的抗肿瘤作用研究[D];中国协和医科大学;1996年

5 秦迎松;人促血液血管细胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）单克隆抗体的制备、鉴定及应用[D];中国协和医科大学;2004年

6 万忠海;抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D];吉林大学;2008年

7 吕大伟;抗RANKL单克隆抗体在大鼠类风湿性关节炎模型中的应用及RANKL转录调控的探索性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

8 庄国洪;抗DR4、DR5单克隆抗体诱导胶质瘤细胞株凋亡的研究[D];吉林大学;2004年

9 付建芳;溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的研究[D];第四军医大学;2005年

10 王晓洁;对虾白斑症病毒快速检测试剂盒的研制及其应用[D];中国海洋大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙杰;人及小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建与鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究[D];苏州大学;2010年

2 黄子逸;LIGHT基因转染细胞株和单克隆抗体的研制及其对T细胞的共刺激效应[D];苏州大学;2010年

3 李铁民;抗P-选择素单克隆抗体对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的作用实验研究[D];中国医科大学;2003年

4 李晓龙;肝癌相关抗原SMP30 mRNA在癌细胞中的表达及其单克隆抗体的制备[D];广西医科大学;2010年

5 郑杰;分泌抗猪流感病毒（河南株）单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备、鉴定和初步应用[D];河南农业大学;2004年

6 邵炜慧;盐酸克伦特罗单克隆抗体的研制及初步应用[D];扬州大学;2005年

7 杨宁;纳豆激酶的纯化及其单克隆抗体的制备鉴定[D];山西农业大学;2005年

8 唐琦;抗麻痹性贝毒素GTX2，，3单克隆抗体的制备及特性分析[D];暨南大学;2005年

9 贾娟娟;抗胰岛素单克隆抗体的研制及酶联免疫分析方法的建立[D];中国原子能科学研究院;2005年

10 李彬;TLR4单克隆抗体诱导同种心脏移植免疫耐受的研究[D];苏州大学;2010年

本文编号：2365105