双酚A对大鼠海马神经元树突发育的影响及其分子机制

发布时间：2018-12-10 13:59

【摘要】： 双酚A(bisPhenol A, BPA)是一种具有代表性的内分泌干扰物,具有弱雌激素活性,广泛用于食品和饮料的包装材料碳酸聚酯、环氧树脂、牙齿填充剂及相关产品的制造。目前,BPA对中枢神经系统的影响越来越受到关注。研究发现BPA不仅可影响脑形态结构的发育,还可影响脑内神经递质系统以及神经行为的发育。树突发育是脑发育的重要过程,其结构和特性决定突触信息的传递功效。发育早期树突分支的生长和结构变化迅速,参与突触发生、树突分支形成,以及树突棘的发育。树突分支过度生长可能导致神经系统功能异常。内源性雌激素影响树突发育和突触发生,因此推测具有雌激素活性的BPA也可能会影响树突的发育。谷氨酸NMDA受体在脑内广泛分布,并且与中枢神经系统的发育密切相关。有研究表明,NMDA受体参与神经回路的形成和学习记忆过程,可以调节神经元的存活,轴突和树突的结构发育以及突触的可塑性等,为所有兴奋性突触的突触后必需组份。而雌激素影响树突发育与NMDA受体有关。鉴于NMDA受体在树突发育中的重要作用,本研究通过BPA染毒体外培养的海马神经元,观察BPA急性和长时暴露对树突形态发育、NMDA受体亚基表达和磷酸化、以及雌激素受体β(Estrogen RecePtor beta, ERβ)表达的影响,以确定发育期BPA暴露是否改变树突形态发生,并影响神经元NMDA受体和雌激素受体的表达,探讨BPA影响神经元树突形态发育是否与NMDA受体相关,雌激素受体是否参与了这一过程,为探索BPA影响中枢神经系统发育奠定基础。方法：采用腺病毒感染体外培养第5天(5 DIV)的海马神经元,使其表达绿荧光,通过活细胞成像观测BPA染毒对海马神经元树突形态动力学变化。实验分5个组：对照组(DMSO), BPA各剂量组(浓度分别为1、10、100、1000 nM)。BPA急性暴露时间为0.5 h,慢性暴露时间为24 h。染毒后,在荧光显微镜下对神经元(7DIV)进行活细胞成像,每2 min拍摄一张图片,共11张1组,动态显现神经元树突的生长。采用Image-Pro Plus分析图像,测定树突丝的运动性(μm/20 min)、树突丝密度以及树突分支总长度。用10μM雌激素受体阻断剂ICI 182,780预处理海马培养物0.5 h,然后再进行BPA染毒,以分析BPA对树突形态发育的影响时否通过雌激素受体进行。通过BPA和10nME2的共同暴露,分析BPA与雌激素对树突发育的共同作用。为了进一步分析BPA影响树突发育的机制,采用细胞免疫染色法,用兔来源多克隆NR1、NR2B、P-NR2B(PhosPhorylated NR2B)和ERβ抗体检测了NMDA受体NR1、NR2B、磷酸化NR2B亚基以及ERβ蛋白的表达,并经Image-Pro Plus分析图像,测定各组细胞的光密度值。结果：1.BPA(10～1000 nM)急性暴露0.5 h快速增加树突丝的运动性和密度(P0.05,P0.01或P0.001),该作用可以被雌激素受体阻断剂抑制(P0.001)；但如果BPA与E2(10 nM)共同给药,BPA或E2单独给药诱导的树突运动性和密度的增加被抑制。BPA(10、100 nM)长时暴露24 h显著增加树突丝的运动性和密度以及树突分支总长度(P0.001),该作用也可被雌激素受体阻断剂抑制(P＜0.05); BPA与E2 (10nM)共同给药,BPA或E2单独给药表现的增强作用被抑制(P0.05)。 2. BPA (10～1000 nM)急性暴露0.5 h,没有改变NR1、NR2B的表达,但却剂量依赖性地上调了磷酸化NMDA受体2B亚基(P-NR2B)的表达(P0.05或P＜0.001),这种上调作用可被雌激素受体阻断剂抑制(P＜0.01)。E2 (10nM)增加磷酸化NR2B的表达,如果BPA与E2共同给药,BPA或E2单独给药诱导的磷酸化NR2B表达上调被抑制(P0.001)。BPA(100、1000 nM)暴露24 h显著下调NR1、NR2B亚基的表达(P0.001),该作用不受雌激素受体阻断剂的影响；E2 (10 nM)上调NR1、NR2B亚基的表达,如果BPA与E2共同给药, E2单独作用诱导NR1、NR2亚基表达的增加受到抑制。 3. BPA (10～1000 nM)急性暴露0.5 h没有引起ERβ蛋白表达的改变,而长时暴露24 h可以上调ERβ蛋白的表达(P0.001),雌激素受体阻断剂可以抑制该作用(P0.01)；BPA与E2共同给药与BPA或E2单独给药对ERp表达的影响无明显差异,均可诱导ERβ表达上调。结论：BPA急性暴露可以快速增加体外培养海马神经元树突丝的运动性和密度,促进NMDA受体2B亚基的磷酸化,但不改变海马神经元NR1,NR2B亚基和ERβ蛋白的表达。雌激素受体可能参与了BPA这些作用,由于核内雌激素受体介导的效应产生作用较慢,推测BPA快速作用可能通过膜雌激素受体进行。 BPA慢性暴露增加树突丝运动性和密度,以及树突分支总长度,促进ERβ蛋白表达,却下调NR1,NR2B亚基的表达。雌激素受体可能参与了BPA增加树突丝运动性和密度、树突分支总长度,以及上调ER表蛋白表达的作用,而BPA对NR1、NR2B表达的影响可能通过其它途径进行。与E2相似,无论急性或慢性暴露,BPA都可增加树突丝运动性和密度以及磷酸化NR2B的表达；而BPA与E2共同暴露时,BPA或E2单独给药对树突丝运动性和密度以及磷酸化NR2B表达的增加作用被抑制,二者表现出相互拮抗作用。综上所述,BPA快速作用影响树突形态发育及NMDA受体的磷酸化活性,该作用可能通过膜相关雌激素受体的介导。慢性暴露不仅可影响树突形态的发育,也可改变NMDA受体蛋白的表达,从而对脑发育产生重要影响。
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【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【引证文献】