我国不同地域烟曲霉临床分离株基因型分析

发布时间：2018-12-12 06:07

【摘要】：背景:近年来，随着院内严重免疫缺陷患者数量的增加，侵袭性曲霉病已成为血液病房、器官移植中心及重症监护病房患者死亡的主要原因，曲霉已成为仅次于念珠菌的一个重要的致病菌。而在致病曲霉中烟曲霉(A.fumigatus)是最主要的致病菌。由于不同国家和地区存在不同的优势致病菌株，采用分子系统学的方法对各个地区的致病烟曲霉进行研究有助于确定致病株流行特征与曲霉种群的关系。目的:1）以我国北京、上海、福建及河北临床分离到的烟曲霉为研究对象，分别通过形态学、镜下特点、温度试验及β-tubulin分子生物学方法鉴定后，再对烟曲霉进行CSP基因分型，从而了解我国不同地域致病烟曲霉临床分离株分布情况。2）检测临床分离到的烟曲霉对不同抗真菌药物的体外敏感性，为临床治疗和采取预防措施提供有意义的线索和指导，并比较不同基因型之间及不同地区之间的烟曲霉的体外抗真菌药物敏感性是否有差异。方法：本研究对我国北京、上海、福建及河北收集到的112株烟曲霉临床分离株分别进行形态学、温度试验及分子生物学测序鉴定后，再对烟曲霉进行细胞表面蛋白（Cell surface protein，CSP）基因分型。本研究所用到的形态学方法主要包括观察培养菌落形态、培养后经乳酸酚棉兰染色镜检。温度试验：将通过形态学方法初步鉴定出的烟曲霉菌株点植于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextroseagar，PDA)上分别置于48℃、45℃、42℃及37℃恒温培养箱中培养3-7天，观察菌落是否生长，从而鉴定至不同的分支。本研究采用玻璃珠破壁、酚-氯仿-异戊醇抽提法提取基因组DNA，然后对β-tubulin进行PCR扩增，并对该区进行测序，应用mega5.0软件对测序所得DNA碱基序列进行编辑，与Genbank数据库中的序列比对，以此鉴定曲霉菌种，最后对鉴定出的烟曲霉进行CSP基因分型，从而了解我国不同地域致病烟曲霉临床株分布情况。同时参照2003年美国临床实验室标准化委员会（National committee for clinical laboratory standards，NCCLS）制定的产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案（M38-A）测定伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B对烟曲霉的最低抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)，以探讨不同基因型烟曲霉与抗真菌药物的敏感性关系，同时比较不同地区的烟曲霉对抗真菌药物的敏感性是否有差异。结果：112株临床分离到的曲霉菌株在PDA的菌落特征和显微镜下特征均符合烟曲霉特征，所有菌株在48℃均能生长，并经β-tubulin测序，与Genbank中多株烟曲霉序列相比呈98%以上一致性，表明都为经典烟曲霉。经典烟曲霉经CSP引物扩增后均生成单一条带约610bp，采用国际标准化命名体系进行CSP分型，共分为11个基因型，较多为t04A， t03和t01，其中1个为新型。对新发现的基因型菌株进行生物学特性的深入研究发现其菌落形态、生长速度、最适生长温度与其他菌株并无显著差别。同时发现福建有12株t10型，另外仅上海和北京各发现一株t10型。7种不同基因型烟曲霉对伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B的敏感性差异无统计学意义，而我国南方地区与北方地区临床分离到的烟曲霉对伊曲康唑的敏感性有统计学意义。结论：我国不同地域致病烟曲霉的基因型存在地域差异，t10型主要在南方气候较暖地区居多，提示了t10型可能在亚热带地区常见。不同基因型的烟曲霉对抗真菌药物的敏感性无统计学意义，，但我国南方地区与北方地区临床分离到的烟曲霉对伊曲康唑的敏感性存在差异。
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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R379

【参考文献】