利用人工设计小RNA抑制铜绿假单胞菌的致病因子表达

发布时间：2018-12-13 17:14

【摘要】：铜绿假单胞菌是临床常见的机会性致病菌,也是目前抗生素耐药最严重的病原菌之一。近几年来,人们提出了靶向细菌致病力的抗感染新思路。针对细菌的某些特定致病机制(如结合、侵入、毒素分泌、破坏宿主防护和信息系统等)靶向阻断其致病过程,从而剥夺其致病力,达到抗感染的目的。与传统的抗感染思路完全不同,它不影响细菌生长,因此不会产生细菌耐药现象,也避免了抗生素所造成的体内微生态紊乱,为有效地控制细菌感染带来了新的机遇和挑战。最近,在细菌体内发现了一类普遍存在、长度在50～200个核苷酸、不能编码蛋白质的RNA,称为细菌非编码小RNA(sRNA)。sRNA在细菌的物质代谢、环境适应、细菌致病力等方面发挥重要的调节作用。在真核生物中,RNAi技术作为一种基因沉默的有效工具得到了广泛的应用,并且已发展成为一种最有前途的疾病防治新方法。在前期研究中,我们分析了大肠杆菌内源非编码小RNA的结构特征,首次建立了人工反式编码小RNA(artificial trans-encoded sRNA, atsRNA)的设计原则,并在大肠杆菌中成功地对靶基因进行了有效的沉默。本文旨在利用人工设计反式编码小RNA干扰铜绿假单胞菌的毒力因子表达并降低致病力,为抗感染和解决细菌耐药难题提供崭新的技术和方法。 首先,我们分析了已知铜绿假单胞菌内源非编码小RNA的共同结构特征,提出了针对铜绿假单胞菌的atsRNA设计原则。以铜绿假单胞菌单基因控制的毒力因子弹性蛋白酶和外毒素A为靶点,分别设计了SRLB和SRTX系列atsRNAs;在铜绿假单胞菌中过量表达atsRNA,并检测靶基因表达水平。实验结果表明,弹性蛋白酶在SRLB2的干扰下,蛋白表达水平降低了57%, mRNA转录水平下降34.9%；外毒素A在SRTX1作用下转录水平表达降低了30.6%。 其次,针对phzABCDEFG操纵子控制的毒力因子绿脓菌素,设计了SRphF系列和SRpzA系列atsRNAS。其中SRphF系列的靶基因phzF是phz操纵子中的第六个基因,编码绿脓菌素合成的关键酶；SRpzA系列的靶基因phzA是phz操纵子第一个基因,与phz启动子区域紧密相连。实验结果显示SRphF系列小RNA干扰效果不明显,效果最好的SRphF2只使绿脓菌素合成量降低了15.8%；而SRphA系列干扰效果较好,SRpzA2干扰效率达到56%,SRpzA3能达到37%。以上说明,以操纵子控制的毒力因子为靶标设计atsRNA时,操纵子最前端基因的核糖体结合位点是有效干扰靶点。在此基础上,构建了靶基因-荧光蛋白融合载体pACYC-T7-phzF-EGFP,并在大肠杆菌BL21中共表达了SRphF系列atsRNAs和pACYC-T7-phzF-EGFP。荧光检测结果显示,在铜绿假单胞菌中干扰效率极低的SRphF系列人工反式编码小RNA在大肠杆菌BL21内干扰效果显著,SRphF2、3、5干扰后荧光表达量均有下降。其中SRphF2干扰后,pACYC-T7-phzF-EGFP荧光表达量下降了83.5%,远远高于其在铜绿假单胞菌种的干扰效率15.4%。这一实验结果表明,两种细菌中atsRNAs的干扰作用存在一定差异。 最后,针对铜绿假单胞菌群体感应rhl和las系统的调控蛋白RhlR和LasR设计了SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs。RT-PCR检测结果表明,SRrhlR4使PAO1菌株rhlR在mRNA水平上降低了79%,并使受rhl系统控制的下游弹性蛋白酶活力降低了36.4%；SRlaR3降低了lasR mRNA的63%,弹性蛋白酶活力降低了32.7%。近年来的研究表明,干扰细菌的群体感应系统可以作为潜在的防治细菌病害的新途径,我们通过SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs成功干扰了rhlR, lasR基因的表达,并一定程度上降低了毒力因子弹性蛋白酶的合成。 综上所述,我们初步建立了一种在铜绿假单胞菌中利用atsRNA干扰毒力因子表达的方法。通过对单基因控制的毒力靶点、操纵子控制的绿脓菌素以及群体感应调控基因的有效干扰,从一定程度上降低了铜绿假单胞菌的致病力,为铜绿假单胞菌引起的相关感染的防治提供了新途径,并为解决细菌耐药难题创造了条件。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 马鹏鹏,薛社普,韩代书;RNA干扰技术的原理与应用[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2003年02期

，

本文编号：2376904