基于TAP技术的PRAK相互作用蛋白质的鉴定

发布时间：2018-12-15 23:23

【摘要】：p38调节活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase, PRAK)最初是作为p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAP kinase/p38 MAPK)的下游激酶被鉴定出来的,属丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MAPK-activated protein kinase, MAPKAP kinase/MK)家族成员；PRAK存在于大多数脊椎动物细胞中,而线虫、果蝇等低等生物不存在编码PRAK的基因；PRAK分子量约54 kD,人的PRAK编码基因编码两种不同剪接体,分别由471和473个氨基酸组成,后者与前者相比,在C-末端多2个氨基酸残基；不同剪接体序列的差异有何功能意义目前仍未清楚。PRAK广泛存在于人的多种组织和细胞系中,尤以心肌及骨骼肌表达水平最高。在静息状态下,外源性PRAK主要分布于细胞核内,在细胞应激时,PRAK可发生核-质移位(nuclear-cytoplasmic translocation);而内源性PRAK的细胞定位则存在争议,不同研究报道的结果不一致。PRAK是MK家族中较新的一个成员,相关研究报道不多；其激活机制、下游底物、介导的功能等,至今仍未完全清楚。早期的研究显示PRAK可受p38 MAPK通路调控,参与细胞应激反应；细胞在应激和致炎因子的刺激下,PRAK的第182位苏氨酸(Thr182)能够被p38MAPK磷酸化而激活,并继而磷酸化并激活热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27),从而介导细胞骨架重构,参与细胞应激反应；而且,p38 MAPK引起的PRAK磷酸化可导致PRAK的核-质移位,但PRAK的移位与其介导的功能有何关系至今未见相关报道。上述关于PRAK参与p38 MAPK介导细胞应激反应的观点近年受到质疑；有研究表明,虽然过表达的p38 MAPK确能磷酸化PRAK,但生理表达水平的内源性p38 MAPK并不能显著增加PRAK活性,而且内源性PRAK也不能有效地激活HSP27；蛋白质相互作用分析也没有发现内源性PRAK- p38 MAPK蛋白质复合体形成的证据。因此,PRAK与p38MAPK通路的关系,以及PRAK的底物可能都需要重新评价。有研究者认为PRAK可能参与癌基因ras的表达产物所诱导的细胞衰老过程,此过程也可能涉及p38MAPK通路；即Ras通过某种方式激活p38 MAPK通路,后者引起PRAK的磷酸化、激活,激活的PRAK再磷酸化、激活p53,从而促进细胞衰老,并抑制细胞恶变。另一PRAK调控因素是细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)成员ERK3和ERK4；研究显示,PRAK能与ERK3/ERK4形成复合体,并磷酸化和激活PRAK,同时引起PRAK核-质移位；PRAK基因敲除会导致小鼠胚胎发育缺陷和死亡,而胚胎死亡发生的时间刚好与ERK3的mRNA在胚胎发育过程中的表达高峰时间相一致；因而推测PRAK可能参与ERK3/ERK4介导的胚胎发育的调控过程,但PRAK通过何种底物发挥此作用尚不清楚。综上所述,PRAK可能参与多种细胞功能的调控过程,但目前对PRAK的功能及其作用机制认识还极为有限,并且在一些问题上还存在着争议；此外,PRAK是否还有其它未发现的激活调控途径以及其它功能?这些问题都需要作进一步研究探讨。细胞中蛋白质往往以多蛋白复合体的方式发挥作用。在许多情况下,功能蛋白质在细胞内的定位和激活后移位以及伴随的与其它蛋白质的可逆性结合是行使其功能的关键所在。因此,研究PRAK与其它蛋白质的相互作用,将有助于揭示其生物学功能及其行使功能的分子机制。串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)耦联质谱(mass spectrometry, MS)分析技术是近年出现的一利,纯化、鉴定蛋白质复合体组分的新策略。TAP技术的核心是：应用分子克隆方法将所研究的蛋白质复合体中一已知蛋白质组分：诱饵蛋白(bait)与两个不同的亲和标签(tag)融合,利用标签与偶联于固相介质的配体之间的亲和结合活性,经过连续两步的亲和纯化,在生理条件下将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白质以蛋白质复合体的形式纯化出来。TAP技术的最大优势在于能获得生理状态下细胞内真实的蛋白质相互作用信息,TAP的应用使蛋白质相互作用的研究在方法学上获得很大的进步。为了获得更多有关PRAK的功能线索,我们引入了Stratagene公司新开发的适合哺乳动物细胞的TAP系统(InterPlay Mammalian TAP System)进行PRAK相互作用蛋白质的鉴定。该系统使用链亲和素结合多肽(streptavidin binding peptide, SBP)和钙调蛋白结合多肽(calmodulin binding peptide, CBP)作为TAP标签；与经典的TAP标签相比,该系统的优点在于：分离的流程不但变得更加简单和经济,而且不需使用蛋白酶酶切,避免了因酶污染对后续质谱分析的影响；此外,SBP标签较小,可有效减少因大分子TAP标签对诱饵蛋白正确折叠的影响而引起的活性变化。在本研究中我们首先将PRAK编码序列克隆到TAP表达载体上,成功构建了重组质粒pNTAP-PRAK;然后,通过Western blot和细胞免疫荧光技术观察了融合蛋白在细胞的表达和定位情况,检测结果表明融合蛋白能有效表达,TAP标签没有明显影响PRAK的细胞定位,融合蛋白也未影响TAP标签中的CBP抗原性。为避免因瞬时转染引起融合蛋白的过高表达及其导致的非天然、非特异的蛋白质相互作用而造成假阳性鉴定结果,我们通过G418筛选,建立起稳定、低水平表达融合蛋白的细胞系HEK293-TAP-PRAK。此外,为排除TAP标签非特异性结合而引起的假阳性结果,我们还建立起稳定转染空载体的HEK293-TAP细胞系作为TAP的阴性对照系统。随后,利用TAP阳性对照质粒观察了TAP系统纯化的效果,预实验结果表明我们的TAP纯化效果是较为满意的。最后,我们利用TAP系统结合荧光差异双向凝胶电泳(difference gel electro-phoresis, DIGE)和质谱鉴定了NaAsO2刺激与非刺激条件下PRAK的差异相互作用蛋白质。DIGE结果分析共获得14个差异大于1.8倍的PRAK相互作用蛋白质差异点(增多的11个,减少的3个),14个差异蛋白质点的质谱分析共鉴定出12个候选差异蛋白质。鉴定出的差异蛋白质包括：参与转录调控的蛋白质、蛋白激酶、参与发育调节和细胞周期调节的蛋白质、参与actin/细胞骨架调节的蛋白质和MAPK信号通路相关的蛋白质等。总之,本实验通过TAP系统纯化分离出HEK293-TAP-PRAK细胞在NaAsO2刺激与非刺激下的PRAK蛋白复合体,纯化产物经DIGE分离,找出差异蛋白点,并对差异蛋白点进行质谱鉴定分析。通过本研究,我们得出以下几点结论： 1.成功把PRAK编码序列克隆到TAP真核表达载体上 2.建立起稳定表达tags (TAP)-PRAK融合蛋白的细胞系(HEK293-TAP-PRAK),稳定表达细胞系的鉴定结果表明稳定表达能有效降低外源蛋白的过高表达,融合标签未对PRAK的表达及其定位产生明显影响,融合蛋白也未影响TAP标签中的CBP抗原性。 3.成功引进了TAP系统,并建立起作为TAP阴性对照的HEK293-TAP稳定表达细胞系。 4.利用TAP系统纯化出NaAsO2刺激与非刺激条件下的PRAK蛋白复合体,经DIGE分析,获得14个蛋白质差异点,质谱鉴定出12个候选差异蛋白质。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【参考文献】