人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用

发布时间：2018-12-20 22:18

【摘要】： 随着人们生活水平的不断提高,Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化发病率不断提高,研究表明血浆中脂联素(ADPN)的含量与这类疾病的发生成负相关,因此检测人血浆中脂联素的含量可预知这类疾病的发生的可能性,可以尽早的为病人提供信息。目前检测人血清中的脂联素含量主要通过ELISA方法进行检测,市面上的检测试剂盒均为进口,国内还没有相关报道。 根据NCBI上公布的序列NM_004797.2,利用primer5.0设计一对引物。提取人脂肪组织总RNA,通过RT-PCR获得732bp的人脂联素全基因目的基因片段。将目的片段克隆入载体pET-CKS并转化感受态细胞E.coli TOP10F',进行PCR鉴定,碱裂解法提取质粒并进行双酶切鉴定,鉴定为阳性的菌株进行测序,将测序结果与NCBI上的序列进行比对,阅读框正确的重组质粒命名为pET-CKS/ADPN。 重组质粒pET-CKS/ADPN转入表达菌E.coli BL21-gold中,在化学剂-异丙基硫代-β-D-半乳酸糖苷(IPTG)的作用自下进行诱导表达,SDS-PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体的形式出现,Western blot检测融合蛋白与兔抗人脂联素抗体反应,证明其具有免疫反应性。通过诱导表达条件的优化,确立了最佳的诱导条件为：30℃,0.1mM IPTG浓度,诱导表达8h。因融合蛋白氨基端含有6个组氨酸(His-tag),可以用镍金属亲和层析纯化目的蛋白,将纯化得到的融合蛋白溶液进行透析复性,检测其浓度较高,可进行动物免疫。 将复性的重组蛋白免疫家兔,间接ELISA检测兔抗血清效价,在第六次免疫后,效价达到5×104左右,双向琼脂扩散实验验证兔抗血清效价,当其效价达到1：64后,杀兔取血,硫酸铵沉淀法和阴离子交换层析法纯化兔抗人脂联素多克隆抗体,测定其浓度为2.3mg/mL。 将抗人脂联素单克隆抗体作为固相抗体,采用改良的碘酸钠法,对人脂联素多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,作为标记抗体,初步建立人脂联素双抗体夹心ELISA检测模式。棋盘滴定法确立人脂联素单克隆抗体的最佳稀释倍数为1：1000,酶标抗体的最佳稀释倍数为1：1500。以重组脂联素蛋白为标准品绘制出的标准曲线,线性范围为2ng-10ng。临床测定111份Ⅱ型糖尿病人血清脂联素浓度为6.5±0.33ng/mL,89份非Ⅱ型糖尿病人血清脂联素浓度为9.9±1.08ng/mLo 本文通过基因工程方法得到了有免疫活性的重组人脂联素蛋白,制备了兔抗人脂联素多克隆抗体,初步建立的人脂联素双抗体夹心检测模型,为进一步研究脂联素的生化性质及生理功能和人脂联素ELISA检测试剂盒的研究奠定基础。
[Abstract]:With the improvement of people's living standard, the incidence of type 鈪，

本文编号：2388500